Characterization of Synaptopodin 2 Subcellular Trafficking during Phenotype Modulation of Vascular Smooth Muscle Cells and Beyond

Abootorabi Ardestani, Mostafa (2015). Characterization of Synaptopodin 2 Subcellular Trafficking during Phenotype Modulation of Vascular Smooth Muscle Cells and Beyond. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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In eukaryotic cells actin is the most abundant protein, forming different cytoskeletal structures and having different functions. Thus, actin plays a crucial role in processes such as the establishment of cellular shape, cell motility, cell adhesion, muscle contraction and cytokinesis. The structures of actin networks and their cellular functions are regulated by other proteins, generally known as actin binding proteins (ABPs). Subject of this work was the investigation of the novel ABP synaptopodin 2 (SYNPO2) and its relevance in vascular smooth muscle cell phenotype modulation. SYNPO2 is involved in the regulation of actin nucleation and remodeling of actin cytoskeleton. SYNPO2 is a dual compartment protein that alters its subcellular localization or shuttles between the cell nucleus and cytoplasm in cardiac and skeletal muscle cells depending on cAMP dependent kinases like protein kinase A (PKA), and calcium/Calmodulin-‐ dependent kinase II (CaMKII). SYNPO2 shuttling occurs in several processes like differentiation, heat shock response, as well as under pathophysiological conditions, such as bladder and prostate cancer. SYNPO2 is abundantly expressed in VSMCs, whereas its functional role in these cells remains elusive. Our results demonstrate that the cAMP-‐mediated PKA pathway is involved in the shuttling of endogenous SYNPO2 between the cell nucleus and the cytoplasm in both directions. As described before, we detected that increased cAMP causes nuclear accumulation of SYNPO2 in VSMCs. Additionally,we show that inhibition of phosphatases like protein phosphatases 1 and 2A (PP1 and PP2A) and/or inhibition of phosphodiesterases (PDEs) affected the accumulation of SYNPO2 in the cytoplasm. Contrary to Weins et al. 2001, reporting a nuclear localization of GFP-‐myopodin upon heat schock, we did not detect any changes in the localization of endogenous SYNPO2 due to heat shock. Furthermore, the phenotype switch of VSMCs not only causes an alteration of subcellular localization of endogenous SYNPO2 but it also affects its expression level. Contractile VSMCs (day one) showed a strong accumulation of SYNPO2 in the cytoplasm, while non-‐contractile (proliferative) VSMCs from passage 3 displayed a strong reduction of cytoplasmic SYNPO2 and an increase in the number of cells with nuclear-‐localized SYNPO2. We observed that plating of VSMCs (passage 3) on laminin-‐ coated matrices led to a back-‐switch from a synthetic phenotype to a contractile phenotype, which subsequently induces an accumulation of SYNPO2 in the cytoplasm. In contrast VSMCs plated on collagen I remain non-‐contractile, displaying nuclear accumulation of SYNPO2. Interestingly, we found an upregulation of SYNPO2 in the contractile phenotype of fresh isolated VSMCs (day one), as well as VSMCs (passage 3) grown on laminin. A new bimolecular fluorescence complementation (BIFC) based assay was established in order to analyze the subcellular localization and the interaction of SYNPO2 with its binding partners. An interaction between the SYNPO2, 14-‐3-‐3β, and importinα was detected in the nucleus, while SYNPO2 interacts with 14-‐3-‐3γ exclusively in the cytoplasm. The nuclear interaction of SYNPO2 with 14-‐3-‐3β was detected in form of nuclear bodies-‐like structures, which were not observed for the SYNPO2-‐importinα complexes. Interestingly, both SYNPO2-‐14-‐3-‐3β and SYNPO2-‐importinα complexes formed a loop-‐like structure. Finally, we show a self-‐association of SYNPO2 in the form homo-‐dimers mainly in the cytoplasm. Taken together, our findings indicate that the novel actin binding protein SYNPO2 plays a potential role in at least three different processes in which phenotype switch is essential, like during cell differentiation and vascular development, after vascular injury (vascular repair) and under pathological conditions like atherosclerosis, cancer. In summary, we may conclude that SYNPO2 is essential for early and late differentiation of VSMCs via mechanisms involving actin and actin-‐mediated transcription networks.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Title	Language
Charakterisierung von Synaptopodin 2 subzellulärer Handel während Phänotyps Modulation Glatten Gefäßmuskelzellen und darüber hinaus	German

Translated abstract:

Abstract

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Zusammenfassung In eukaryotischen Zellen stellt Aktin das Protein mit der höchsten Abundanz dar, besitzt diverse Funktionen und ist Hauptbestandteil des Zytoskeletts. Daher spielt Aktin eine wichtige Rolle für die Entstehung und Erhaltung der Zell Form, der Zellmotilität, der Zelladhäsion, der Muskelkontraktion und der Zytokinese. Die Struktur des Aktinnetzwerks und seine zellulären Funktionen werden von Proteinen reguliert, welche allgemein als Aktin bindende Proteine (ABP) bekannt sind. Gegenstand dieser Arbeit war die Analyse eines neuen ABPs Synaptopodein 2 (SYNPO2) und seine Relevanz für die Phänotyp Modulation in vaskulären Glattmuskelzellen (vascular smooth muscle cell; VSMC). SYNPO2 ist maßgeblich an der Regulation von Aktin Nukleation und dem Umbau des Aktin Zytoskeletts beteiligt. SYNPO2 ist ein Dual-‐ Kompartiment Protein, welches seine subzelluläre Lokalisation zwischen dem Nukleus und dem Zytoplasma in Herz-‐ und Skelettmuskelzellen ändert. Dieser Prozess geschieht in Abhängigkeit einer cyclischen Adenosinmonophosphats (cAMP)-‐abhängigen Phosphorylierung des SYNPO2 durch Protein kinase A (PKA) und Calcium/calmodulin-‐ dependent protein kinase II (CaMKII). Die unterschiedliche SYNPO2 Lokalisation spielt in vielen Prozessen, wie der Zelldifferenzierung, der Antwort auf Hitzeschock und unter pathophysiologischen Bedingungen, wie z. B. Blasen-‐ und Prostatakrebs eine bedeutende Rolle. SYNPO2 wird abundant in VSMCs exprimiert, wobei seine Rolle in diesen Zellen jedoch bis jetzt unbekannt ist. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, dass der cAMP-‐abhängige PKA Signalweg am Pendeln von endogenem SYNPO2 zwischen Zellkern und Zytoplasma in beiden Richtungen beteiligt ist. Wie bereits beschrieben, konnten in Folge von erhöhtem cAMP eine Akkumulation von SYNPO2 im Zellkern detektieren werden. Des Weiteren legen wir dar, dass die Inhibierung der Protein Phosphatase 1 (PP1), der Protein Phosphatase 2A (PP2A) und/oder der Inhibierung von Phosphodiesterasen (PDEs) einen Einfluss auf die Anreicherung von SYNPO2 im Zellkern hat. Im Gegensatz zu Weins et al. 2001, die eine nukleäre Lokalisation von SYNPO2 in Folge eines Hitzeschocks zeigten, konnten wir nach einem Hitzeschock keine Veränderung in der Lokalisation des endogenen SYNPO2 feststellen. Zudem verursacht die Phänotypänderung der VSMCs nicht nur eine subzelluläre Lokalisationsänderung des endogenen SYNPO2, sondern beeinflusst auch dessen Expressionsrate. Kontraktile VSMCs (Tag 1) weisen eine starke Akkumulation von SYNPO2 im Zytoplasma auf, während nicht kontraktile (proliferative) VSMCs aus Passage 3 eine starke Reduktion von zytoplasmatischem SYNPO2 und einen Anstieg von nukleärem SYNPO2 aufweisen. Wir konnten feststellen, dass die Aussaht von VSMCs (Passage 3) auf einer lamininbeschichteten Matrix zu einer Umkehrung des Phänotyps von nicht-‐kontraktil zu kontraktil und somit zu einer Akkumulation von SYNPO2 im Zytoplasma führt. Im Vergleich dazu, verbleiben VSMCs nach Aussaht auf Collagen I Beschichtung, im nicht-‐kontraktilen Zustand und weisen eine Akkumulation von SYNPO2 im Nukleus auf. Interessanterweise wurde darüber hinaus eine Hochregulation von SYNPO2 im kontraktilen Phänotyp bei frisch isolierten VSMCs (Tag 1), als auch bei VSMCs, die auf Laminin kultiviert wurden, nachgewiesen. Um die subzelluläre Lokalisation von SYNPO2 und dessen Interaktion mit potentiellen Bindungspartnern zu analysieren wurde ein bimolekularer fluoreszenzkomplementations (bimolecular fluorescence complementation; BIFC) Ansatz etabliert. Es konnte eine Interaktion zwischen SYNPO2, 14-‐3-‐3β und Importinα im Nukleus beobachtet werden, während SYNPO2 mit 14-‐3-‐3β ausschließlich im Zytoplasma interagiert. Diese Interaktion von SYNPO2 mit 14-‐3-‐3β wurde in Form von ‚nuclear bodies‘-‐ähnlichen Strukturen, welche nicht für den SYNPO2-‐ Importinα Komplex festgestellt werden konnte. Interessanterweise, formen beide Komplexe SYNPO2-‐14-‐3-‐3β und SYNPO2-‐Importinα ringförmige Strukturen. Zuletzt konnten wir zeigen, dass SYNPO2 Homodimere bildet, die hauptsächlich im Zytoplasma vorkommen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass das neue Aktin bindende Protein SYNPO2 eine potentiell wichtige Rolle in mindestens drei Prozessen spielt, die mit einer Phänotypänderung einhergehen. Zum Ersten, während der Zelldifferenzierung und der vaskulären Entwicklung, des Weiteren für die Reparatur nach Gefäßverletzung und zuletzt unter pathologischen Umständen wie Arteriosklerose oder Krebs. Abschließend können wir sagen, dass SYNPO2, durch Aktin selbst und durch das Aktinnetzwerk vermittelte Transkription, einen wesentlichen Teil zu der frühen und späten Differenzierung von VSMCs beiträgt.

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