Universität zu Köln

Zicola, Johan (2016). Characterization of transcriptional enhancers in plants using Arabidopsis thaliana and Zea mays as model species. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Enhancers are non-coding regions of the genome controlling the transcription of genes located at distances ranging from kilo to mega bases. Enhancers act mainly as binding platforms for multiple transcription factors and were shown to interact directly with the promoter of their target genes. Since few enhancers are characterized in plants, we developed a pipeline to find new enhancers based on previous knowledge from plant and animal case studies. To do so, the two plant models Arabidopsis thaliana and Zea mays were used. Both functional and genome-wide approaches were used to study known enhancers in A. thaliana and Z. mays and identify putative enhancers in Z. mays. The characterization of novel enhancers in plants provides more insight about gene regulatory networks in plants. In fine, a better understanding of gene regulation could help improving important traits of cultivated plants by conventional breeding or biotechnological improvement. In A. thaliana, enhancers of the FLOWERING LOCUS T (FT) were characterized by inducing DNA methylation using Inverted Repeats (IRs). Indeed, DNA methylation was often associated with the inactivation of cis-regulatory elements such as enhancers and promoters in mammals and for some cases in plants. DNA methylation deposition at the previously characterized enhancer Block C led to downregulation of FT expression and subsequent late flowering phenotype in FT-inducing growth conditions. A novel putative enhancer of FT, named Block E, was found downstream of the gene and shared several features with Block C such as accessible chromatin, conserved sequences among Brassicaceae, and putative transcription factor binding sites present at Block C. Transgenic lines containing an IR targeting a part of Block E displayed a late flowering phenotype, which was not as strong as for Block C, but significantly higher than other lines used as control and displaying a mild late flowering phenotype. We conclude that IR-targeted DNA methylation is a useful tool that can allow characterization of known enhancers and discovery of putative ones. In Z. mays, differential chromatin accessibility, Histone 3 lysine 9 acetylation (H3K9ac) enrichment level, and gene expression profile were obtained for two different tissues (young seedling leaves and husk) in order to define enhancers’ location, activity, and associated genes. Enhancers were previously shown to be in most cases located in accessible chromatin, and to contain associated histone marks such as H3 lysine 27 acetylation (H3K27ac), H3 lysine 4 monomethylation (H3K4me1), or H3K9ac. We first verified whether our data could properly define known or putative enhancers and the expression of their target genes. Indeed, we could find both high chromatin accessibility and H3K9ac enrichment level for the known enhancers of teosinte branched1 (tb1) and booster1 (b1), and the corresponding expression fold change of the target genes across the two tissues. By combining chromatin accessibility and H3K9ac enrichment level data, we could determine ≈2000 candidate enhancers in intergenic regions. We could finally associate for each tissue about 20 differentially expressed genes to about 20 putative tissue-specific enhancers, which will be characterized by transient expression assays in the future.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Enhancer sind nicht-kodierende Regionen des Genoms, die die Transkriptionsrate von Genen kontrollieren, von denen sie einige Tausenden bis zu Millionen von Basenpaaren entfernt sind. Enhancer sind Bindungsplattformen für mannigfache Transkriptionsfaktoren, und es ist nachgewiesen worden, dass Enhancer physisch direkt mit Zielgenpromotoren interagieren können. Da über Enhancer in Pflanzen wenig bekannt ist, war es Ziel dieser Arbeit, ein Arbeitsprogramm zu entwickeln, das neue Enhancer aufgrund aus durch Modellstudien in Pflanzen und Tieren bekannter gemeinsamer Eigenschaften aufgespürt. Um dies zu erreichen, wurden Untersuchungen an den Pflanzen Arabidopsis thaliana and Zea mays durchgeführt. Sowohl funktionelle also auch genomweite Ansätze dienten dazu bekannte Enhancer aus beiden Modellen weiter zu untersuchen mit dem Ziel, neue Enhancer in Z. mays zu beschreiben. Charakterisierung neuer Enhancer hilft, die regulatorischen Gennetzwerke besser zu verstehen. Im Endeffekt kann solch besseres Verstehen der Genregulation helfen, Nutzpflanzen entweder durch konventionelle oder molekulare Züchtung in ertragsrelevanten Eigenschaften zu verbessern. In A. thaliana wurden Enhancer des FLOWERING LOCUS T (FT) durch künstliche Methylierung untersucht, die durch sogenannte „inverted Repeats (IRs)“ gezielt an diesen induziert wurde. Der Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und der Inaktivierung von Enhancern und Promotoren ist in Säugetieren und auch einigen Fällen in pflanzlichen Modellen gut beschrieben. Methylierung des bekannten FT Enhancers Block C führte zur Reduktion der FT Expression, die mit einer Verzögerung des Blühzeitpunkts, unter Anzuchtsbedingungen in denen FT induziert wird, einherging. Ein neuer möglicher FT Enhancer, jetzt als Block E bezeichnet, wurde abwärts des FT Gens gefunden. Block E ähnelt Block C in vielen Eigenschaften wie dem Auftreten einer offenen Chromatinstruktur, Konservierung der Sequenz innerhalb der Brassicaceae und der Präsenz mehrerer gemeinsamer Transkriptionsfaktorbindestellen. Auch transgene Linien, die Block E überlappende IRs expremierten, blühten signifikant später als Kontrollen, wenn auch nicht so spät, wie die entsprechenden Block C Linien. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass IR-induzierte Methylierung ein Mittel ist, um Enhancer zu validieren und weiter zu untersuchen. In Z. mays wurden genomweiter Profile von offenem Chromatin, Histone H3 Acetylierung an Lysin 9 (H3K9ac), sowie Expressionsprofile in zwei Geweben (junge Pflanzen und Kolbenblätter) erstellt, um Enhancerkandidaten zu lokalisieren und Zielgenen zuzuordnen. Es war beschrieben, dass Enhancer oft in offenem Chromatin lokalisieren und mit Histonmodifikationen H3 Acetylierung an Lysine 27 (H3K27ac), H3 Monomethylierung and Lysine 4 (H3K4me1) oder H3K9ac assoziiert sind. Als erstes wurde validiert, welche dieser Modifikationen an bekannten Enhancern in Z. mays auftreten. Offenes Chromatin und H3K9ac Anreicherung waren an den beschriebenen Enhancern der teosinte branched1 (tb1) and booster1 (b1) Loci vorhanden, deren Expression auch in beiden untersuchten Geweben unterschiedlich war. Im Weiteren wurden durch Überlappen von offenen Chromatin- und H3K9ac-Profilen ca. 2000 Enhancerkandidaten in intergenischen Regionen aufgezeigt. Von diesen konnten ca. 20 differentiell offen und acetylierte Enhancer mit differentiel expremierten Genen assoziiert werden. Diese Gruppe von Enhancerkandidaten soll in weiterführenden Studien experimentell validiert werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zicola, Johan johan.zicola@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-67865
Date:	4 April 2016
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Agriculture
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language enhancer, transcriptional regulation, DNA methylation, epigenetics, chromatin accessibility English
Date of oral exam:	6 June 2016
Referee:	Name Academic Title Coupland, George Prof. Dr. Höcker, Ute Prof. Dr. de Meaux, Juliette Prof. Dr. Turck, Franziska Dr.
Funders:	Marie Skłodowska-Curie ITN EpiTRAITS (GA-316965)
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6786