Pepanian, Anna, Sommerfeld, Paul ORCID: 0000-0002-8182-0347, Kasprzyk, Renata, Kuehl, Toni, Binbay, F. Ayberk, Hauser, Christoph, Loeser, Reik, Wodtke, Robert, Bednarczyk, Marcelina, Chrominski, Mikolaj, Kowalska, Joanna, Jemielity, Jacek ORCID: 0000-0001-7633-788X, Imhof, Diana and Pietsch, Markus (2022). Fluorescence Anisotropy Assay with Guanine Nucleotides Provides Access to Functional Analysis of G alpha i1 Proteins. Anal. Chem., 94 (41). S. 14410 - 14419. WASHINGTON: AMER CHEMICAL SOC. ISSN 1520-6882
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G alpha proteins as part of heterotrimeric G proteins are molecular switches essential for G protein-coupled receptor -mediated intracellular signaling. The role of the G alpha subunits has been examined for decades with various guanine nucleotides to elucidate the activation mechanism and G alpha protein-dependent signal transduction. Several approaches describe fluorescent ligands mimicking the GTP function, yet lack the efficient estimation of the proteins' GTP binding activity and the fraction of active protein. Herein, we report the development of a reliable fluorescence anisotropy-based method to determine the affinity of ligands at the GTP-binding site and to quantify the fraction of active G alpha i1 protein. An advanced bacterial expression protocol was applied to produce active human G alpha i1 protein, whose GTP binding capability was determined with novel fluorescently labeled guanine nucleotides acting as high-affinity G alpha i1 binders compared to the commonly used BODIPY FL GTP gamma S. This study thus contributes a new method for future investigations of the characterization of G alpha i and other G alpha protein subunits, exploring their corresponding signal transduction systems and potential for biomedical applications.
Item Type: | Journal Article | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Creators: |
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URN: | urn:nbn:de:hbz:38-681555 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DOI: | 10.1021/acs.analchem.2c03176 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Journal or Publication Title: | Anal. Chem. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Volume: | 94 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Number: | 41 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Page Range: | S. 14410 - 14419 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Date: | 2022 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Publisher: | AMER CHEMICAL SOC | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Place of Publication: | WASHINGTON | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ISSN: | 1520-6882 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Language: | English | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Faculty: | Unspecified | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Divisions: | Unspecified | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Subjects: | no entry | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Uncontrolled Keywords: |
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URI: | http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/68155 |
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