Universität zu Köln

Aslanidis, Alexander (2016). Characterization of photoreceptor gene regulation and modulation of microglial reactivity in the retina. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Photoreceptors are highly specialized cells required for phototransduction within the retina and thus crucial for visual perception. Inherited retinal diseases are mainly caused by mutations in photoreceptor-specific genes, the majority of which is regulated by the key transcription factor cone rod homeobox (CRX). Using genome-wide chromatin immunoprecipitation data (CRX ChIP-seq), we have identified a novel sterile alpha motif (SAM) domain containing protein, SAMD7, as a CRX target. SAMD7 is expressed in the mouse retina and pineal gland and localizes to the cytoplasm and nucleus of photoreceptor cells. SAMD7 expression is regulated by CRX, which binds to two specific regions in the promoter and first intron (enhancer) of the SAMD7 gene. Consequently, CRX knock-down leads to a significant decrease of SAMD7 enhancer activity and protein levels in the retina. Functionally, SAMD7 acts as a transcriptional repressor of CRX-mediated photoreceptor gene expression, indicating that mutations in or dysregulation of SAMD7 could lead to disturbed photoreceptor homeostasis and ultimately retinal degeneration. Microglial cells are the resident macrophages of the central nervous system (CNS), including the retina, and play pivotal roles in innate immune responses and regulation of homeostasis in the healthy and degenerating CNS. Reactive microgliosis is a common hallmark of neurodegenerative diseases and chronic pro-inflammatory microglial reactivity contributes to disease progression. We have previously identified activated microglia/macrophage whey acidic protein (AMWAP) as a biomarker for microglial reactivity and counter-regulator of pro-inflammatory response. AMWAP is actively secreted from lipopolysaccharide (LPS)-activated microglia and recombinant AMWAP is taken up by microglial cells in a paracrine fashion and effectively reduces TLR2- and TLR4-mediated pro-inflammatory gene expression. AMWAP exerts its anti-inflammatory function through blockade of NFκB activation, as it inhibits proteolysis of the NFκB pathway mediators IRAK-1 and IκBα without preventing IκBα phosphorylation and ubiquitination or affecting overall 20S proteasome activity. Functionally, AMWAP reduces pro-inflammatory microglial nitric oxide (NO) secretion and neurotoxicity on photoreceptor cells in vitro. Further, AMWAP promotes filopodia formation of microglia and increases the phagocytic recognition and uptake of apoptotic photoreceptor debris, common features of homeostatic regulatory microglia. We therefore hypothesize that anti-inflammatory whey acidic proteins (WAPs) could have therapeutic potential in neurodegenerative diseases of the brain and retina. The translocator protein (18 kDa) (TSPO) is a mitochondrial protein expressed in reactive glial cells and a biomarker for gliosis in the brain but has not been investigated in a retinal context so far. Various TSPO ligands have been shown to reduce neuroinflammation in neurodegenerative mouse models. We could show strong upregulation of TSPO transcript and protein levels in reactive microglial cells in vitro, microglia of the retinoschisin-deficient retinal degeneration mouse model as well as TSPO expression in microglia of the human retina. TSPO mRNA expression is high in the developing mouse retina and declines to low levels in the adult tissue. The synthetic TSPO ligand XBD173 effectively suppresses pro-inflammatory microglial gene expression, migration, proliferation, NO secretion and neurotoxicity on photoreceptors in vitro. Further, XBD173 treatment promotes filopodia formation and increases the phagocytic recognition and uptake of latex beads and apoptotic photoreceptor debris by murine and human microglial cells in vitro. Finally, XBD173 effectively reduces the number of amoeboid alerted microglia in organotypic murine retinal explant cultures stimulated with LPS. In conclusion, we have identified TSPO as a novel marker for microglial reactivity in the retina and a potential therapeutic target to reduce chronic neuroinflammation during retinal degeneration. In summary, our studies on the novel photoreceptor gene regulator SAMD7 and the microglial reactivity markers AMWAP and TSPO provide insights into potential disease mechanisms of retinal degeneration and suggest future strategies of identifying and therapeutically modulating pro-inflammatory microglial reactivity in degenerative diseases of the CNS and retina.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Charakterisierung der Photorezeptor Genregulation und Modulation mikroglialer Reaktivität in der Netzhaut German
Translated abstract:	Abstract Language Photorezeptorzellen sind hoch spezialisierte Zellen innerhalb der Netzhaut, welche die Phototransduktion vermitteln und daher essentiell für die Aufnahme und Verarbeitung visueller Sinnesreize sind. Erbliche Netzhautdystrophien werden vornehmlich durch Mutationen in Photorezeptor-spezifischen Genen verursacht, von welchen die Mehrzahl durch den Schlüsseltranskriptionsfaktor cone rod homeobox (CRX) reguliert wird. Mit Hilfe eines genomweiten Chromatin Immunpräzipitations-Datensatzes (CRX ChIP-seq), konnten wir ein neuartiges, sterile alpha motif (SAM) Domänen beinhaltendes Protein, SAMD7, als CRX Zielgen identifizieren. SAMD7 wird in der Mausnetzhaut und Zirbeldrüse exprimiert und lokalisiert im Zytoplasma und Nukleus von Photorezeptorzellen. Die SAMD7 Expression wird durch CRX reguliert, welches an zwei spezifischen Regionen im Promotor und ersten Intron (Enhancer) im SAMD7 Gen bindet. Somit führt CRX knock-down zu einer signifikanten Abnahme der regulatorischen Aktivität des SAMD7 Enhancers und der SAMD7 Proteinlevel in der Netzhaut. Funktionell agiert SAMD7 als Transkriptionsrepressor der CRX-vermittelten Photorezeptor-Genexpression, was darauf hindeutet, dass Mutationen in oder Dysregulation von SAMD7 zu gestörter Photorezeptor-Homöostase und letztlich zu Netzhautdegeneration führen könnten. Mikrogliazellen sind die gewebsansässigen Makrophagen des zentralen Nerven-systems (ZNS), inklusive der Netzhaut, und spielen eine wichtige Rolle in der Immunantwort und Regulation der Homöostase im gesunden sowie degenerierenden ZNS. Reaktive Mikrogliose ist ein typisches Merkmal neurodegenerativer Erkrankungen und chronische proinflammatorische Mikrogliaaktivierung beschleunigt den Krankheitsverlauf. Wir konnten in Vorarbeiten das activated microglia/ macrophage whey acidic protein (AMWAP) als Biomarker für reaktive Mikroglia und Gegenspieler der proinflammatorischen Mikrogliaantwort identifizieren. AMWAP wird aktiv von Lipopolysaccharid (LPS)-aktivierten Mikroglia sezerniert und rekombinantes AMWAP wird in parakriner Weise von Mikroglia aufgenommen in welchen es effektiv die TLR2- und TLR4-vermittelte proinflammatorische Genexpression reduziert. AMWAP erzielt diese antiinflammatorische Wirkung durch Blockade der NFκB Aktivierung, indem es die Proteolyse der NFκB Signalwegsmediatoren IRAK-1 und IκBα verhindert ohne die IκBα Phosphorylierung, Ubiquitinierung oder die allgemeine 20S Proteasomaktivität zu beeinflussen. Funktionell reduziert AMWAP die proinflam-matorische mikrogliale Stickstoffoxidsekretion und Neurotoxizität gegenüber Photo-rezeptorzellen in vitro. Des Weiteren induziert AMWAP die Bildung mikroglialer Filopodien und erhöht die phagozytische Aufnahmefähigkeit von apoptotischem Photorezeptordebris, typische Charakteristika homöostatischer und regulatorischer Mikroglia. Wir schließen aus diesen Ergebnissen, dass antiinflammatorische whey acidic proteins (WAPs) therapeutisches Potential in neurodegenerativen Erkran-kungen des Gehirns und der Netzhaut haben könnten. Das Translokatorprotein (18 kDa) (TSPO) ist ein mitochondriales Protein, welches in reaktiven Gliazellen exprimiert ist, als Gliosemarker im Gehirn fungiert und bisher noch nicht im retinalen Kontext untersucht wurde. Verschiedene TSPO Liganden reduzieren Neuroinflammation in neurodegenerativen Mausmodellen. Wir konnten eine starke Hochregulation der TSPO Transkript- und Proteinlevels in reaktiven Mikrogliazellen in vitro, Mikroglia des Retinoschisin-defizienten Mausmodells sowie TSPO Expression in Mikroglia der humanen Netzhaut nachweisen. TSPO ist auf mRNA Ebene stark in der sich entwickelnden Mausnetzhaut exprimiert und sinkt auf ein niedrigeres Niveau im adulten Gewebe. Der synthetische TSPO Ligand XBD173 verringert effektiv die proinflammatorische mikrogliale Genexpression, Migration, Proliferation, Stickstoffoxid-Sekretion und Neurotoxizität gegenüber Photorezeptor-zellen in vitro. Außerdem induziert XBD173 die Bildung mikroglialer Filopodien und erhöht die phagozytische Aufnahmefähigkeit von Latexkügelchen und apoptotischem Photorezeptordebris durch murine und humane Mikrogliazellen in vitro. Weiterhin reduziert XBD173-Behandlung effektiv die Zahl amöboider, alarmierter Mikroglia-zellen in LPS-stimulierten organtypischen Netzhautexplantatkulturen. Schluss-folgernd konnten wir TSPO als neuartigen Marker der Mikrogliaaktivierung in der Netzhaut und potentielle therapeutische Zielstruktur zur Reduktion chronischer Neuroinflammation während Netzhautdegeneration identifizieren. Zusammenfassend ermöglichen unsere Untersuchungen zum neuartigen Photorezeptor-Genregulator SAMD7 und den mikroglialen Reaktivitätsmarkern AMWAP und TSPO einen Einblick in mögliche Pathomechanismen retinaler Degeneration und offenbaren Möglichkeiten zur Identifizierung und therapeutischen Modulation pro-inflammatorischer Mikrogliaaktivität in degenerativen Erkrankungen des ZNS und der Netzhaut. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Aslanidis, Alexander alexander.aslanidis@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Creators:	Lehrstuhl für Experimentelle Immunologie des Auges, Zentrum für Augenheilkunde, Klinikum der Universität zu Köln
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-69182
Date:	2016
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Microglia, Retina, Photoreceptors English
Date of oral exam:	16 November 2015
Referee:	Name Academic Title Eming, Sabine Prof. Dr. med. Kloppenburg, Peter Prof. Dr. rer. nat.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6918