Universität zu Köln

Heuser, Sandra (2016). Mechanism of HPV8-E7 mediated keratinocyte invasion. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

High-risk patient groups, such as immunosuppressed organ-transplant recipients and patients with the inherited skin disease Epidermodysplasia verruciformis, exhibit cancerisation of the skin, which are positive for human papillomaviruses (HPV) of the genus beta (e.g. HPV8). Transgenic mouse models, expressing either all HPV8 early proteins (E1, E2/E4, E6, E7) or E2 and E6 individually, develop skin papillomas with varying degrees of dysplasia and squamous cell carcinoma. The specific contribution of the viral E7 protein to tumour formation and the molecular mechanism for HPV8 induced keratinocyte invasion was not known. During this study, a transgenic mouse model expressing the HPV8-E7 oncoprotein in the murine epidermis under the control of the keratin-14 promoter was generated and proved a carcinogenic potential of HPV8-E7 in vivo. It could previously be shown that HPV8-E7 induces keratinocyte invasion in organotypic skin cultures (OSCs), which were based on de-epidermalised dermis, whereby invasion could not be triggered in OSCs based on collagen type I. Therefore, it was hypothesised that the composition of the extracellular matrix (ECM) enables HPV8-E7 mediated keratinocyte invasion. We now could show, that the adherens and tight junction proteins β-catenin and zona occludens-1 are strongly upregulated in E7 positive keratinocytes in OSC, in the skin of HPV8-E7 transgenic mice and in betaHPV positive human skin lesions. When cells were grown on a fibronectin matrix, E7-positive keratinocytes acquired an invasive cell phenotype which was accompanied by an epithelial-mesenchymal-transition mediated cadherin switch leading to E-cadherin down-, and N-cadherin up-regulation. In addition, E7-positive keratinocytes displayed enhanced fibronectin expression and secretion and stimulated dermal fibroblasts to express fibronectin. When grown on fibronectin, E7-positive keratinocytes exhibited increased cell surface levels of the integrin α3 chain. Functional blocking of α3 using siRNA confirmed α3 as a critical molecule sufficient to induce E7-mediated invasion. This mechanistic link was further supported by the fact that the invasion-deficient E7-mutant L23A did not target cell surface levels of α3. Furthermore, high α3 levels were coupled with an upregulation of the fibronectin-associated ECM protein Fibulin-2, known to mediate a transformed cell phenotype. Using E7wt and E7-L23A positive cell extracts and Co-IP/mass spectrometric analysis the cellular factors ATP5B, PTRF/cavin-1 and phosphatidylserine could be identified as possibly important for keratinocyte invasion. These findings highlight the importance of cell-cell and epithelial-ECM interactions required for keratinocyte invasion and provide mechanistic evidence for the role of betaHPV in skin carcinogenesis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Mechanismus der HPV8-E7 induzierten Keratinozyten Invasion UNSPECIFIED
Translated abstract:	Abstract Language Sowohl Patienten mit der erblichen Hautkrankheit Epidermodysplasia verruciformis, als auch immunsuppremierte Organtransplantatempfänger stellen Patientengruppen dar, die ein erhöhtes Risiko zur Bildung von Hautkrebs vorweisen. Diese Karzinome sind positiv für humane Papillomviren des Genus beta, wie z.B. HPV8. Transgene Mausmodelle, die entweder alle frühen Proteine von HPV8 (E1, E2/E4, E6, E7) oder nur das E2 oder E6 Protein exprimieren, entwickeln Papillome unterschiedlicher Schweregrade und Plattenepithelkarzinome der Haut. Der spezifische Einfluss des viralen E7 Proteins auf die Tumorentwicklung und der molekulare Mechanismus der HPV8 induzierten Keratinozyten-Invasion war bisher nicht bekannt. In dieser Studie wurde ein transgenes Mausmodel generiert, welches das HPV8-E7 Protein unter der Kontrolle des Keratin-14 Promotors exprimiert, womit ein karzinogenes Potential für E7 in vivo nachgewiesen werden konnte. In vitro konnte bisher gezeigt werden, dass HPV8-E7 positive Keratinozyten nur in organotypischen Hautkulturen invadierten, die auf de-epidermierter Dermis basierten, wohingegen auf Kollagen I basierter Matrix keine Invasion beobachtet werden konnte. Diese Befunde führten zur Hypothese, dass Bestandteile der extrazellulären Matrix die HPV8-E7 induzierte Keratinozyten-Invasion ermöglicht. Wir konnten nun zeigen, dass die Adhesion- und Tight-Junction Proteine β-catenin und Zona Occludens-1 in E7 positiven organotypischen Hautkulturen, sowie in HPV8-E7 transgener Maushaut als auch in betaHPV-positiven humanen Hautläsionen stark hochreguliert sind. Nach der Kultivierung von Keratinozyten auf Fibronektin, entwickelten E7 positive Zellen einen invasiven Zellphänotypus, der mit einer epithelialen-mesenchymalen Transition und einem ‚Cadherin -Switch‘ verbunden war, was zu einer Runterregulierung von E-Cadherin und einer Hochregulierung von N-Cadherin führt. Außerdem zeigten E7-positive Keratinozyten eine erhöhte Fibronektin-Expression sowie Sekretion und stimulierten die Fibronektin-Expression in dermalen Fibroblasten. Auf einer Fibronektin-Matrix kultivierte E7 positive Keratinozyten wiesen ein erhöhtes Level der Integrin α3 Untereinheit auf der Zelloberfläche auf. Die Runterregulation des Integrin α3 durch siRNA verdeutlichte die entscheidende Rolle von α3 in der E7 induzierten Invasion. Diese mechanistische Verknüpfung wurde durch die Tatsache bekräftigt, dass die Invasions-defiziente E7-L23A Mutante keine veränderte Integrin α3 Menge auf der Zelloberfläche zeigte. Des Weiteren war eine erhöhte Menge von α3 mit der Hochregulierung des Fibronektin-assoziierten Matrixproteins Fibulin-2 verbunden, was bekannter Weise einen transformierenden Zellphänotypus unterstützt. Mit Hilfe von E7wt und E7-L23A positiven Zellextrakten und Co-IP/massenspektrometrischer Analysen wurden die zellulären Faktoren ATP5B, PTRF/Cavin-1 und Phosphatidylserin als mögliche wichtige Faktoren für die Keratinozyten-Invasion identifiziert. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass sowohl Zell-Zell als auch Zell-Matrix-Interaktionen durch E7 moduliert werden, wodurch die Invasion von Keratinozyten ermöglicht wird. Somit konnten weitere mechanistische Ergebnisse für die Rolle von betaHPV in der Entstehung des Plattenepithelkarzinoms erbracht werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Heuser, Sandra sandra_heuser@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-69649
Date:	2016
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Skin cancer English Human papillomavirus HPV8 English non-melanoma skin cancer (NMSC) English HPV8-E7 English keratinocyte invasion English
Date of oral exam:	1 July 2016
Referee:	Name Academic Title Schumacher, Björn Prof. Dr. Pfister, Herbert Prof. Dr. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6964