Universität zu Köln

Gries, Raphael ORCID: 0000-0003-2392-388X (2024). Deciphering Novel Modes of Action of Lead Compounds with Antibacterial or Anti virulence Activity against Mycobacterium tuberculosis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Tuberculosis (TB) is a communicable disease that is responsible for serious health problems around the globe. TB is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and can be effectively treated with an extensive treatment regimen. However, incompetent application of this regimen is the cause for the prevalent emergence of multidrug-resistant Mtb strains, which are no longer sensitive to first-line antibiotics. Furthermore, the current drug development pipeline for novel antibiotics targeting Mtb, while promising, still lacks the diversity of targets needed to introduce a variety of novel mechanisms of action. This circumstance is partly caused by the robustness of Mtb against bioactive compounds. The major reason for this is the unique, impermeable cell wall containing additional layers of mycolic acids. An alternative approach to conventional antibiotics is the adjunct application of anti-virulence drugs. These compounds target specific mycobacterial components or substrates (virulence factors) that are essential for the host cell infection by Mtb. As a result, the pathogen’s efficacy in infection is compromised and it can potentially be more easily cleared by the host. The most notable virulence factor of Mtb is the type VII secretion system ESX-1 and its substrates EsxA and EsxB. In this thesis, 60,000 compounds were tested in a medium-throughput screening for anti-Mtb activity. This screening utilized different combinatorial applications of the screening platform by combining testing for growth inhibitory activity and host cell survival (cytoprotection) during Mtb infection. This includes both conventional antibiotically active compounds as well as anti virulence compounds, which show no antibiotic activity but still exhibit cytoprotective activity against Mtb. Investigation of the genome of Mtb mutants resistant to the antibiotics revealed putative modes of action associated with cell wall biogenesis, amino acid production and the respiratory chain. One notable compound (B6) inhibited the respiratory chain and additionally demonstrated great potential for combinatorial application with the frontrunner drug Q203, due to a unique cross-resistance pattern. Furthermore, several anti-virulence compounds exhibited inhibitory activity against ESX-1. Transcriptional analysis suggests that the compound S3 boosts the efficacy of the antibiotic prodrug ethionamide, which was subsequently confirmed by synergistic activity testing. Consequent analysis of structural analogues of this compound identified two similar molecules that also inhibit ESX 1 but differ in their respective booster effect. While one analogue (S3_106) did not exert this effect, the other (S3_100) similarly enhances the efficacy of ethionamide by utilizing a different molecular pathway for prodrug activation. This thesis describes an early stage of drug discovery for two different, but potentially synergistic, classes of compounds with activity against Mtb, either antibiotic or anti-virulence. The discovered molecules and the deciphering of their modes of action show great potential and represent an important step progressing from drug discovery towards clinical application for combating multidrug-resistant Mtb.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Tuberkulose (TB) ist eine Infektionskrankheit, die weltweit für ernsthafte Gesundheitsproblemen sorgt. TB wird durch Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht und kann effektiv mit einem aufwendigen Behandlungsschema behandelt werden. Allerdings kann die unsachgemäße Anwendung dieses Schemas zur Entstehung von multiresistenten Mtb Stämmen, welche nicht mehr auf First Line Antibiotika ansprechen, beitragen. Darüber hinaus fehlt es derzeit im Bereich der Wirkstoffentwicklung für neuartige Antibiotika gegen Mtb trotz vielversprechender Ansätze noch an der benötigten Vielfalt neuer Wirkungsmechanismen. Dieser Umstand ist teilweise auf die Robustheit von Mtb gegenüber bioaktiven Substanzen zurückzuführen. Der Hauptgrund dafür ist die einzigartige, undurchlässige Zellwand von Mtb, welche zusätzliche Schichten von Mykolsäuren enthält. Neben der Forschung an konventionellen Antibiotika werden aktuell auch alternative Ansätze verfolgt, wie zum Beispiel die adjunkte Anwendung von Anti-Virulenz-Wirkstoffen. Diese zielen auf spezifische mykobakterielle Komponenten oder Substrate (Virulenzfaktoren) ab, welche essentiell für die erfolgreiche Infektion der Wirtszelle durch Mtb sind. Durch die Hemmung von Virulenzfaktoren wird die Wirksamkeit des Erregers bei der Infektion stark beeinträchtigt und das Pathogen kann möglicherweise leichter vom Wirt bekämpft werden. In dieser Arbeit wurde ein Screening mit medium-throughput durchgeführt, bei dem 60.000 Verbindungen auf ihre anti-Mtb-Aktivität getestet wurden. Dabei wurden die Substanzen auf verschiedene Eigenschaften geprüft, indem Tests auf wachstumshemmende Aktivität und Überleben der Wirtszellen (Zytoprotektion) während der Mtb-Infektion kombiniert wurden. Somit konnten sowohl herkömmliche antibiotisch wirksame Verbindungen als auch anti Virulenz-Verbindungen identifiziert werden. Letztere zeichnen sich dadurch aus, dass sie explizit nicht das Wachstum von MtB hemmen, aber trotzdem Wirtszellen während der Infektion mit Mtb vor dem Zelltod schützen. Um dem Wirkmechanismus der antibiotisch aktiven Substanzen auf den Grund zu gehen, wurde das Genom von Mtb-Mutanten, die gegen die jeweilige Verbindung resistent waren, analysiert. Diese Genomuntersuchung identifizierte verschiedene Proteine, welche im Zusammenhang mit der Zellwandbiogenese, der Aminosäureproduktion und mit der Atmungskette stehen, als mutmaßliche Ziele. Eine dieser Verbindungen (B6), welche die Atmungskette hemmt, zeigte auch großes Potenzial für eine kombinierte Anwendung mit dem Wirkstoff Q203. Darüber hinaus zeigten mehrere anti-Virulenz-Verbindungen eine hemmende Wirkung gegenüber dem Typ VII-Sekretionssystem ESX-1, welches einen der wichtigsten Virulenzfaktoren von Mtb darstellt. Eine folgende Transkriptionsanalyse ergab außerdem, dass die Verbindung S3 die Wirksamkeit des Antibiotikums Ethionamid verstärkt, was durch entsprechende synergistische Wachstumsexperimente nachgewiesen werden konnte. Bei der anschließenden Analyse von Strukturanaloga dieser Verbindung wurden Moleküle identifiziert, die ebenfalls ESX-1 hemmen, sich aber in ihrer jeweiligen verstärkenden Wirkung unterscheiden. Während das eine Analogon (S3_106) diese Wirkung nicht ausübte, verstärkte das andere (S3_100) die Wirksamkeit von Ethionamid in ähnlicher Weise, allerdings durch ein alternatives Enzym. Insgesamt beschreibt diese Arbeit eine frühe Phase der Arzneimittelentdeckung für zwei unterschiedliche, aber potenziell synergistische Klassen von Verbindungen mit Aktivität, entweder antibiotisch oder anti-virulent, gegen Mtb. Die hier entdeckten Moleküle und die Entschlüsselung ihrer Wirkmechanismen zeigen großes Potenzial und stellen einen wichtigen Schritt auf dem Weg von der Arzneimittelentdeckung zur klinischen Anwendung gegen multiresistente Mtb dar. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Gries, Raphael raphael.gries@gmx.de orcid.org/0000-0003-2392-388X UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-720154
Date:	January 2024
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Mycobacterium tuberculosis, type VII secretion system, anti-virulence, EsxA, EsxB, antibiotic, ethionamide, prodrug, ATP, QcrB, cytochrome bc1, drug screening English
Date of oral exam:	6 December 2023
Referee:	Name Academic Title Cornely, Oliver Prof. Schnetz, Karin Prof.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/72015