Universität zu Köln

Savcigil, Deniz Pinar ORCID: 0000-0002-9217-5582 (2024). Identification and Characterisation of Novel Mechanisms Regulating TNF-Induced Cell Death. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Cell death is a fundamental biological process for tissue homeostasis and tissue remodelling during development and for the defence against a vast range of stressors. However, uncontrolled cell death can impair these programs causing severe pathological consequences. Thus, the regulation of cell death is a critical step to trigger proper immune responses and healing processes following stress conditions. Tumour necrosis factor (TNF), a proinflammatory cytokine secreted during different stress conditions, can determine cell fate, either cell survival and proliferation or cell death, the latter via the formation of a cytosolic, cell death-inducing complex, called complex II. Checkpoints are specific mechanisms in TNF signalling that control the decisison between cell survival and death and, within the latter, control the amplitude of cell death. Therefore, these checkpoints have a high pathophysiological relevance. Hence, our goal is to gain a deeper molecular understanding of how these mechanisms regulate the cytotoxic potential of TNF. Cellular FLICE inhibitory protein (cFLIP) is a crucial regulator of TNF-induced cell death. cFLIP is cleaved at D377 by Caspase-8. Yet, the physiological role of cFLIP cleavage in the regulation of TNF-mediated cell death outcomes remains elusive. Here, we discovered that cFLIP cleavage counterbalances complex II assembly and cytotoxicity. Consequently, abrogation of cFLIP cleavage by the D377A mutation sensitizes cells to TNF-induced cell death by favouring complex II formation. The cell death sensitizing effect of D377A mutation depends on the C-terminal residues of the caspase-like domain on cFLIP, in particular the Q469 resiude. To address the physiological funtions of cFLIP cleavage, we generated a novel mouse line bearing a non-cleavable version of cFLIP (CflipD377A/D377A). These mice exhibited increased tissue damage caused by Sharpin deficiency, impaired skin wound healing and increased lethality upon SARS CoV-1 infection. These results reveal a previously unknown and unexpected role for cFLIP cleavage in the modulation of cell death amplitude during tissue stress, to ensure the execution of repair programs. Furthermore, we successfully generated and validated a novel genetic tool to study the composition of complex II using an immunoprecipitation-based mass spectrometry-coupled, unbiased approach. As an interesting candidate, we identified protein phosphatase 2 scaffold subunit A alpha (PPP2R1A), a constant regulatory subunit of protein phosphatase 2 (PP2A). The first biochemical and functional investigations indicated the involvement of PPP2R1A in the regulation of TNF-induced cell death. To conclude, we unravelled new layers of regulatior machinery that safeguards TNF-induced complex II-mediated cell death. Our findings therefore provide a better understanding of the role of cell death in health and disease.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Identifizierung und Charakterisierung neuer regulatorische Mechanismen des TNF-induzierten Zelltodes German
Translated abstract:	Abstract Language Der Zelltod ist ein biologischer Prozess der Gewebehomöostase während der Entwicklung und in den Abwehrreaktionen. Unkontrollierter Zelltod stört jedoch die Reparaturprogramme und hat schwerwiegende pathologische Folgen. Daher ist die Regulierung des Zelltodes entscheidend, um angemessene Immunreaktionen auszulösen und die Homöostase aufrechtzuerhalten. Der Tumornekrosefaktor (TNF) ist ein wichtiges Zytokin, das bei verschiedenen Stresssituationen freigesetzt wird. Es steuert das überlebenswichtige Zellgeschehen. Es kann zwischen das Überleben und Prolifereation oder Zelltod, für letzteres durch die Bildung eines zytosolischen, Zelltod induzierenden Komplexes, gennant Komplex II. Daher regulieren sogenannte „Checkpoints“ der TNF Signalweg, ob eine Zelle überlebt oder stirbt und im Letzterem kontrollieren sie das Ausmaß des Zelltodes. Daher haben diese Checkpoints eine hohe pathophysiologische Relevanz. Unser Ziel ist ist es daher, ein tieferes molekulares Verständnis dafür zu erlangen, wie diese Mechanismen das zytotoxische Potenzial von TNF regulieren. Zelluläre FLICE inhibitorische Protein (cFLIP) ist ein entscheidender Regulator des TNF-induzierten Zelltodes. Darüber hinaus spaltet Caspase-8 cFLIP an D377. Jedoch ist die physiologische Rolle dieser Spaltung unklar. Hier zeigte es sich, dass die cFLIP Spaltung Komplex II Bildung und dessen Zytotoxizität. Folglich sensibilisiert die genetische Blockade der cFLIP Spaltung die Zellen für die TNF-induzierten Zelltod, indem sie die Bildung von Komplex II begünstigt. Dies hängt von den C-terminalen Aminosäuren des cFLIPs, insbesondere Q469, ab. Um physiologische Rolle der cFLIP Spaltung zu untersuchen, wurde eine neue Mauslinie mit der nicht spaltbaren cFLIP (CflipD377A/D377A) generiert. Diese Mäuse zeigten erhöhte Gewebeschaden durch Defizit an Sharpin, gestörte Wundheilung und erhöhte Letalität bei der SARS CoV-1 Infektion. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in die Funktion von cFLIP bei der präzisen Kontrolle der Amplitude von Zelltod, um die Reparaturprogrammen zu gewährleisten. Zusätzlich dazu wurde ein neues genetisches Model zur Untersuchung von Komplex II entwickelt. Diese Immunpräzipitation und Massenspektrometrie basierten Ansatz weist auf einen interessanten Kandidatprotein hin: die Proteinphosphatase 2 Scaffold Subunit A Alpha (PPP2R1A), die konstante regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 2 (PP2a). Erste Untersuchungen deuteten auf die Beteiligung von PPP2R1A an der Regulierung des TNF-induzierten Zelltods hin. Schließlich haben wir neue Ebenen der Regulationsmaschinerie aufgedeckt, die den TNF-induzierten Zelltod bei verschiedenen Stimuli absichern. Diese ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Rolle des Zelltods bei Gesundheit und Krankheit bei. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Savcigil, Deniz Pinar UNSPECIFIED orcid.org/0000-0002-9217-5582 UNSPECIFIED
Contributors:	Contribution Name Email Censor UNSPECIFIED UNSPECIFIED Censor UNSPECIFIED UNSPECIFIED Censor UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-731848
Date:	2024
Place of Publication:	Köln
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Cell death, TNF,TNF-induced cell death, Complex II, cFLIP, cFLAR, FADD, Caspase-8, checkpoints English
Date of oral exam:	30 April 2024
Referee:	Name Academic Title Annibaldi, Alessandro PhD Hofmann, Kay Prof. Dr. Morandi, Andrea Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/73184