Universität zu Köln

Matic, Stanka (2016). Molecular mechanisms of mitochondrial DNA replication. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF PhD_thesis_Stanka_Matic_Final.pdf Download (41MB)

Abstract

Mitochondria are cellular organelles responsible for energy conversion to form the cell’s energy currency, adenosine triphosphate (ATP), through the process of oxidative phosphorylation. In addition, mitochondria play a vital role in diverse cellular processes including apoptosis, calcium homeostasis and intracellular signalling. As a consequence, mitochondrial dysfunction can lead to numerous disorders that display variability in clinical presentation and tissue specificity. Mitochondria contain their own genome, known as mitochondrial DNA (mtDNA), and have distinct enzymes involved in mtDNA expression and maintenance. Even though the core components of the machinery necessary for mtDNA replication have been identified and reconstituted in vitro, its underlying regulatory mechanisms are largely unknown. The displacement (D) loop, a triple stranded structure that is formed by premature replication termination generating the 7S DNA, likely plays an important role in the control of mammalian mtDNA replication in response to cellular bioenergetics demands. The work described in this thesis aimed to study the effects of the mitochondrial replicative helicase TWINKLE and the mitochondrial nuclease MGME1 on mtDNA replication regulation. Both of these factors were previously described to impact 7S DNA levels. The effects of TWINKLE on mtDNA levels were studied by generating Twinkle bacterial artificial chromosome (BAC) transgenic mice. This TWINKLE overexpressor model showed that TWINKLE upregulation leads to an increased replication and augmented mtDNA copy number. To study the in vivo role of the MGME1 nuclease in mtDNA replication regulation, Mgme1 knockout mice were generated and analyzed. Our results show that MGME1 is not essential for mouse embryonic development and survival. This MGME1 knockout model showed mtDNA depletion, and accumulation of an 11-kb linear mtDNA fragment that spans the entire major arc of the mtDNA and is present in different mouse tissues. Interestingly, a similar linear fragment was also present in mice carrying an exonuclease deficient DNA polymerase (mtDNA mutator mice). These mice show a progeroid phenotype that is likely not driven by linear deletions as Mgme1 knockout mice do not display a premature ageing phenotype. Finally, we dissected the role of MGME1 in mtDNA replication and transcription. The lack of abortive replication events and diminished H-strand transcription termination in Mgme1 knockout mice suggests a possible role of MGME1 in the regulation of those processes at the end of the D-loop region.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Mitochondrien sind essentielle Zellorganellen, die durch den Prozess der oxidativen Phosphorylierung für die Energiegewinnung der Zelle in Form von Adenosintriphosphat (ATP), zuständig sind. Zusätzlich spielen Mitochondrien eine wesentliche Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen, einschließlich Apoptose, Kalziumhomöostase und intrazellulärer Signalwege. Daraus folgt, dass mitochondriale Dysfunktion zu einer Vielzahl von Funktionsstörungen führen kann, die eine ganze Bandbreite von klinischen Befunden und gewebsspezifischen Auswirkungen widerspiegeln. Mitochondrien besitzen ihr eigenes Genom, bekannt als mitochondriale DNA (mtDNA), und haben eigene, spezielle Enzyme, die bei der mtDNA Expression und Replikation involviert sind. Obwohl die Hauptkomponenten, die zur Replikation der mtDNA benötigt werden, bekannt sind und in vitro rekonstruiert wurden, sind die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen weitestgehend unbekannt. Der Displacement (D) Loop, eine dreisträngige Struktur, die durch einen verfrühten Replikationsabbruch entsteht und aus der die 7S DNA hervorgeht, spielt vermutlich in Säugetieren eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der mtDNA Replikation als Antwort auf bioenergetische Bedürfnisse. Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Effekte der mitochondrialen replikativen Helikase TWINKLE und der mitochondrialen Nuklease MGME1 auf die Regulation der Replikation von mtDNA. In der Vergangenheit wurde bereits für beide Faktoren gezeigt, dass sie die Quantität von 7S DNA beeinflussen. Die Auswirkungen von TWINKLE auf die mtDNA Level wurden anhand von transgenen Mäusen, die Twinkle in einem künstlichen Bakterienchromosom (BAC) tragen und überexprimieren, untersucht. Anhand dieses Modells konnte gezeigt werden, dass die Hochregulierung von TWINKLE zu einer vermehrten Replikation und erhöhten Kopienzahl von mtDNA führt. Um die in vivo Rolle der Nuklease MGME1 während der Regulation der mtDNA Replikation zu untersuchen, wurden Mgme1 knockout Mäuse generiert und analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MGME1 für die Entwicklung und Vitalität von Mausembryonen nicht essentiell ist. Die Mäuse des MGME1 Knockout Modells zeigten eine Depletion der mtDNA und eine Akkumulierung eines linearen 11-kb-Fragments von mtDNA, welches den gesamten major arc der mtDNA umfasst und in verschiedenen Mausgeweben präsent ist. Interessanterweise gibt es ein vergleichbares lineares Fragment in Mäusen, die eine mutierte DNA Polymerase mit defizienter Exonuklease besitzen (mtDNA Mutator Mäuse). Diese Mäuse zeigen einen vorzeitigen Alterungsphänotyp, der vermutlich nicht von linearen Deletionen verursacht wird, da dies bei Mgme1 knockout Mäuse nicht der Fall ist. Abschließend untersuchten wir die Rolle von MGME1 sowohl bei der mitochondrialen Replikation als auch bei der Transkription. Das Ausbleiben verfrühter Replikationsabbrüche sowie verminderter Termination der H-Strang Transkription in Mgme1 knockout Mäusen deutet auf eine mögliche Rolle von MGME1 bei der Regulation dieser wichtigen Prozesse am Ende der D-Loop Region hin. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Matic, Stanka stanka.matic@yahoo.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-73557
Date:	2016
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language mitochondrial DNA replication English TWINKLE English MGME1 English D-loop English mitochondrial non-coding region English
Date of oral exam:	16 January 2017
Referee:	Name Academic Title Larsson, Nils-Göran Prof. Dr.
Funders:	Max Planck Society
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/7355