Universität zu Köln

Wang, Shu (2024). Generation of conditional CRISPR Cas9 mediated knockout mice without off-target effects using the traffic light system. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

CRISPR/Cas9-Technologien können verwendet werden, um Gene in bestimmten murinen Zelltypen zu zerstören, die Cas9 und eine gRNA gegen das interessierende Gen exprimieren. Die ordnungsgemäße gRNA-Abgabe und die durch Cas9 induzierten genetischen Läsionen können jedoch noch nicht in vivo überwacht werden, und es kann zu unerwünschten Auswirkungen übermäßiger Cas9/gRNA im Zelltyp kommen. Zu diesem Zweck wurde ein ROSA26-Locus-gesteuertes, selbstzerstörendes sCas9-P2A-AAVR-E2AtdTomato -Konstrukt entwickelt, das durch Cre- und Dre-vermittelte Rekombination aktiviert werden kann. Die Cre/Dre-vermittelte Entfernung von loxP- und rox-flankierten Stoppkassetten führte zur zusammengesetzten Expression von sCas9, AAVR und tdTomato in Zellen, die beide Rekombinasen exprimieren. Spezifische gRNAs gegen sCas9/tdTomato und gegen das Gen von Interesse werden über Adeno-assoziierte Viren (AAV) übertragen, die effizient an den AAV-Rezeptor AAVR gebunden werden, der zusammen mit sCas9 und tdTomato exprimiert wird. Darüber hinaus weist die Lieferung von AAVs, die U6-gesteuerte gRNAs gegen sCas9/tdTomato und das interessierende Gen sowie Cre-, Dre- oder Cre/Dre-induzierbare ZsGreen-Kassetten tragen, auf Cas9-Aktivität über einen Rot-Grün-Schalter in der Fluoreszenz aufgrund der Selbstzerstörung von hin sCas9/ tdTomato und Aktivierung der ZsGreen-Expression. Dieses neuartige Ampelsystem ermöglicht es, die Überwachung der Genbearbeitung mithilfe von sCas9 auf bestimmte Zelltypen zu beschränken und die Off-Target-Effekte von Cas9 auf das Genom durch Selbstzerstörung des Cas9 (sCas9) -Proteins zu begrenzen. Die metabolische Dysfunktion-assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) ist in vielen Ländern ein wachsendes Gesundheitsproblem. Das erste Stadium der MASLD ist durch eine übermäßige Fettansammlung in Hepatozyten, dem Hauptzelltyp der Leber, gekennzeichnet, gefolgt vom zweiten Stadium der Entzündung, dem Stadium der metabolischen Dysfunktions-assoziierten Steatohepatitis (MASH), das sich weiter auf die dritte Leber ausbreiten kann Fibrosestadium. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die die Entwicklung von MASH vorantreiben, nicht vollständig geklärt. Wir untersuchten die Rolle von STAT5 bei MASH, indem wir Hepatozyten-spezifische STAT5-spezifische Knockout-Mäuse unter metabolischer und fibrotischer MASH-Diät analysierten. Unsere Daten deuten darauf hin, dass Mäuse mit hepatischem STAT5-Mangel (STAT5LKO) unabhängig von der Ernährungsweise im Vergleich zu STAT5fl/fl-Mäusen eine erhöhte Ablagerung von Lipidtröpfchen und eine Infiltration entzündlicher Zellen in der Leber aufwiesen. Interessanterweise war die Expression von Genen bei STAT5LKO-Mäusen unter fibrotischer Ernährung deutlich reduziert. Im Gegenteil, unter NCD- und MASH-Ctrl-Bedingungen zeigten STAT5LKO-Mäuse im Vergleich zu Ctrl-Mäusen eine erhöhte Fibrose-Genexpression. Daher kann die hepatische STAT5-Stummschaltung bei verschiedenen diätetischen Eingriffen während der Entwicklung einer Lebererkrankung eine doppelte Rolle spielen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Generation of conditional CRISPR Cas9 mediated knockout mice without off-target effects using the traffic light system English
Translated abstract:	Abstract Language CRISPR/Cas9 technologies can be used to disrupt genes in specific murine cell types which express Cas9 and a gRNA against the gene of interest. However, proper gRNA delivery and the genetic lesions induced by Cas9 cannot be monitored in vivo yet, and there might be off target effects of excessive Cas9/gRNA in the cell type. To this end, a ROSA26 locus-driven, self-destructing sCas9-P2A-AAVR-E2AtdTOMATO construct has been developed that can be activated by Cre- and Dre-mediated recombination. Cre/Dre-mediated excision of loxP- and rox-flanked stop cassettes lead to the compound expression of sCas9, AAVR, and tdTOMATO in cells expressing both recombinases. Specific gRNAs against sCas9/tdTomato and gene of interest are delivered via adeno-associated viruses (AAV) that will be efficiently bound by the AAV receptor AAVR co-expressed with sCas9 and tdTOMATO. Moreover, delivery of AAVs carrying U6-driven gRNAs against sCas9/td tdTomato and the gene of interest as well as Cre, Dre or Cre/Dre inducible ZsGreen cassettes indicates Cas9 activity via a red to green switch in fluorescence, owing to the self-destruction of sCas9/tdTOMATO and activation of ZsGreen expression. This novel traffic light system allows for monitoring gene editing using sCas9 to be restricted to specific cell types and to limit the off-target effects of Cas9 on the genome by self-destructing the Cas9 (sCas9) protein. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) is a growing health problem in many countries. The first stage of MASLD is characterized by excessive fat accumulation in hepatocytes, the main cell type of the liver followed by the second stage of inflammation, which is the stage of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH) that can further progress to the third liver fibrosis stage. However, the molecular mechanisms driving the development of MASH are not completely understood. We investigated the role of STAT5 in MASH by analyzing hepatocyte-specific STAT5-specific knockout mice on metabolic and fibrotic MASH diets. Our data suggest that independent under which dietary regimen, hepatic STAT5-deficient (STAT5LKO) mice exhibited increased lipid droplet deposition and inflammatory cell infiltration in the liver compared with the STAT5fl/fl mice. Interestingly, under fibrotic diet-fed condition, the expression of genes was markedly reduced in the STAT5LKO mice. On the contrary, under NCD and MASH-Ctrl conditions, STAT5LKO mice showed elevated fibrosis gene expression compared with Ctrl mice. Thus, hepatic STAT5 silencing may play a dual role in different dietary interventions during the development of liver disease. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Wang, Shu swang916916@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-744015
Date:	2024
Language:	English
Faculty:	Faculty of Medicine
Divisions:	Faculty of Medicine > Innere Medizin > Poliklinik für Endokrinologie, Diabetologie und Präventivmedizin
Subjects:	Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language CRISPR/Cas9 English Cre/loxP English off-target effects English MASH English STAT5-deficient English
Date of oral exam:	5 September 2024
Referee:	Name Academic Title Brüning, Jens Dr. med. Zevnik, Branko Dr. rer. nat.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/74401