Universität zu Köln

Hoffmann, Eva Sabrina (2024). Strategies to investigate and engineer reverse transciptases with an expanded substrate repertoire. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

RNA aptamers, evolved by in vitro selection, are of great interest for the application as diagnostic or therapeutic tools, as they bind their target with high affinity and specificity. The application of unnatural base pairs (UBPs) to RNA aptamer selection expands their chemical diversity, thereby generating more versatile interaction sites. Some highly developed UBPs are replicated and transcribed with natural-like efficiencies, but the reverse transcription, a key step in RNA aptamer development, has not been thoroughly examined. This thesis provides detailed insights into the reverse transcription process with UBPs, employing the TPT3:NaM pair. To this end, a series of versatile strategies were developed for the investigation of different reverse transcriptases (RTs) regarding their ability to process UBPs. Significant differences in polymerase activities were detected by real-time monitoring of reverse transcription kinetics. The determination of the fidelity demonstrated efficient UBP processing in a single reverse transcription step for three tested RTs. To evaluate the potential application of UBPs in RNA aptamer selection, a novel electromobility shift assay based on iEDDA click chemistry was established to monitor UB retention during the selection process. This assay revealed a notable UB loss over iterative cycles of RNA aptamer selection for all RTs. However, SuperScript IV RT was identified as the most efficient RT for TPT3:NaM processing, making it a promising candidate for polymerase engineering. To facilitate the evolution of RTs with an expanded substrate repertoire, an emulsion-based selection strategy for polymerase engineering was developed. This strategy will allow for the specific selection of RTs that process the UBP. The herein presented investigation has elucidated the reverse transcription of UBPs and extends the toolbox for the investigation of enzymatic UB processing. Moreover, it contributes to the development of novel RTs efficiently processing UBPs, thereby paving the way towards the generation of new UB-modified RNA aptamers as potential therapeutics.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Nutzung von RNA Aptameren als therapeutische und diagnostische Tools ist vom großen Interesse, da sie ihr Zielmolekül mit hoher Affinität und Spezifität binden. Unnatürliche Basenpaare (UBPs) erweitern die chemische Vielfalt von Nukleinsäuren und werden daher die Entwicklung neuer RNA Aptamere mit zusätzlichen Bindungsstellen ermöglichen. Während einige UBPs mit einer hervorragenden Effizienz repliziert und transkribiert werden, ist die Reverse Transkription von UBPs als ein Schlüsselschritt in der in vitro Selektion von RNA Aptameren bisher nur wenig untersucht worden. Die vorliegende Arbeit liefert detaillierte Einblicke in die Reverse Transkription mit UBPs unter der Nutzung des TPT3:NaM Basenpaars. Eine Reihe neuer Methoden wurde entwickelt, die eine umfassende Untersuchung von verschiedenen Reversen Trankriptasen (RTs) hinsichtlich ihrer Fähigkeit UBPs zu verarbeiten ermöglicht. Kinetische Echtzeit-Kontrolle der Reversen Transkription offenbarte signifikante Unterschiede in der Polymerasen-Aktivität. Die Bestimmung der Polymerasen-Genauigkeit zeigte eine effiziente Verarbeitung des UBPs während einer einzelnen Reversen Transkription Reaktion für drei verschiedene RTs. Um die Anwendung des UBPs in der Selektion von RNA Aptameren zu evaluieren, wurde ein neuartiger Elektromobilität Shift-Assay basierend auf iEDDA Click Chemie entwickelt, der es ermöglicht die Retention der UB während des Selektionsprozesses von RNA Aptameren nachzuverfolgen. Dadurch wurde ein Verlust des UBPs mit steigender Anzahl der Selektionszyklen für alle RTs festgestellt. Von den getesteten RTs verarbeitete SuperScript IV RT das TPT3:NaM Basenpaar mit der höchsten Effizienz, sodass sie als Ausgangspunkt für eine weitere Polymerasenentwicklung identifiziert wurde. Für die Evolution von RTs mit erweiterten Substrat-Repertoire wurde daher ein neues Emulsions-basiertes Selektionssystem entwickelt. Diese Methode wird voraussichtlich die spezifische Selektion von RTs, die das UBP erfolgreich verarbeiten, ermöglichen. Die präsentierten Ergebnisse tragen zur Aufklärung der Reverse Transkription mit UBPs bei und die entwickelten Methoden erweitern die vorhandenen Möglichkeiten zur Untersuchung der enzymatischen Verarbeitung von UBPs. Zusätzlich liefert die Arbeit einen Beitrag zur Entwicklung neuer RTs mit verbesserter UBP-Prozessierung, welche essenziell für die Herstellung neuer UB-modifizierter RNA Aptamere, insbesondere als mögliche Therapeutika, sind. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hoffmann, Eva Sabrina UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-751958
Date:	2024
Place of Publication:	Köln
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Organic Chemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language nucleic acids English unnatural base pairs English reverse transcription English nucleic acid modifications English nucleic acid functionalization English SELEX English RNA aptamers English expanded genetic alphabet English polymerase evolution English
Date of oral exam:	24 September 2024
Referee:	Name Academic Title Kath-Schorr, Stephanie Prof. Dr. Baumann, Ulrich Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/75195