Identification and characterization of antigen-specific T cells in infectious disease and cancer using the example of SARS-CoV-2 and bladder carcinoma

Dörnte, Charlyn ORCID: 0000-0002-7417-4658 (2025). Identification and characterization of antigen-specific T cells in infectious disease and cancer using the example of SARS-CoV-2 and bladder carcinoma. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Antigen-specific T cells are an essential pillar of the adaptive immune system. They can directly kill target cells and orchestrate the immune responses by other innate and adaptive immune cells. For viral SARS-CoV-2 infections in particular, virus-specific immune responses have been shown to be directly linked to improved disease outcomes, including faster and more efficient clearing of the harmful pathogen from the organism. Therefore, in the course of the COVID-19 pandemic, this PhD project was initiated aiming for the identification of virus-specific T cell epitopes. We were able to successfully identify numerous T cell epitopes in the form of 15-mer and 9-mer peptides with restriction to different HLA allotypes. This was done using in vitro peptide stimulation assays and accompanying in silico peptide binding predictions. The mapping of immunogenic protein regions for three different cohorts also allowed us to identify differences between vaccination- and infection-induced T-cell immunity. Furthermore, the correlation to protein regions with high mutational load found in the currently circulating SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) virus strains led to speculation about the potential protection of individuals against these virus strains. Since no evidence was found for a direct correlation between T cell immunogenic regions and mutation rates, we conclude that a major reorganization of the spike protein would be necessary to allow complete evasion of the virus from the T cell immunity built up by vaccination and natural infection with pre-omicron variants. This hypothesis is further supported by our analysis of the SARS-CoV-2 Omicron-specific T cell response in double and triple-vaccinated individuals. Here, we showed that booster vaccinations, even with first-generation vaccines, lead to increased reactivity of virus-specific CD4+ and CD8+ T cells. In addition, the proportion of T cell responses against non-mutated regions of SARS-CoV-2 Omicron increased with the third vaccination, indicating a general benefit of booster vaccinations against evolving virus strains as well. We then wanted to investigate possible causes of severe COVID-19 infections. In collaboration with Dr. Angeliki Datsi and Prof. Dr. Johannes Fischer from the University Hospital Düsseldorf, we analyzed the immunogenic regions of SARS-CoV-2 structural proteins for individuals expressing HLA haplotypes associated with more severe COVID-19 disease progression. We found no differences in the ability to present T-cell peptides via HLA molecules between individuals with positive- or negative-associated HLA haplotypes. However, in individuals with generally more severe COVID-19 disease courses (long disease severity and duration), we found a lower frequency of virus-specific CD8+ T cells, accompanied by high bystander activation. Individuals with negative-associated HLA haplotypes, which are characterized by longer disease duration, showed significantly increased virus-specific CD4+ T cell frequencies, accompanied by increased titers of neutralizing antibodies. Although effective, the method used is inefficient in analyzing SARS-CoV-2-specific T-cell responses. This is mainly due to the high heterogeneity of the human HLA system. Therefore, in the course of this dissertation, we propose a new technology for the identification of T-cell epitopes: the multiplex HLA binding assay. This novel method is sensitive and efficient, as it allows for multiplexing. As a proof-of-concept, this assay will be demonstrated on the identification of neoantigens from human bladder carcinomas. Although sequencing analyses are still pending, we were able to dissect the tumor samples into individual cell suspensions and analyze the immunophenotypic composition of these samples. This showed a varying and staging-independent infiltration of the tumor with immune cells. The identification of neoantigens from bladder cancer samples, which are characterized by a high mutation load, is therefore of great interest with regard to the possible application of cellular therapies directed against them.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Identifizierung und Charakterisierung antigen-spezifischer T Zellen in Infektions- und Krebserkrankungen am Beispiel von SARS-CoV-2 und Blasen-Karzinom.	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Antigen-spezifische T Zellen sind eine wesentlicher Bestandteil des adaptiven Immunsystems. Sie sind in der Lage, Zielzellen direkt abzutöten und die Immunreaktionen anderer angeborener und adaptiver Immunzellen zu steuern. Insbesondere für virale SARS-CoV-2-Infektionen hat sich gezeigt, dass virus-spezifische Immunantworten direkt mit einem verbesserten Krankheitsverlauf assoziiert sind, einschließlich einer schnelleren und effizienteren Beseitigung des schädlichen Erregers aus dem Organismus. Daher wurde im Zuge der COVID-19-Pandemie dieses Promotionsprojekt mit dem Ziel der Identifizierung von virusspezifischen T-Zell-Epitopen initiiert. Wir konnten erfolgreich zahlreiche T-Zell Epitope in Form von 15-mer und 9-mer Peptiden mit Restriktion zu verschiedenen HLA-Allotypen identifizieren. Dies geschah mit Hilfe von in vitro, Peptid-basierten Stimulations-Assays und begleitenden in silico Peptid-MHC Bindungs-Vorhersagen. Die Kartierung immunogener Proteinregionen für drei verschiedenen Kohorten, ermöglichte uns außerdem, Unterschiede zwischen der Impfungs- und Infektions-induzierten T-Zell-Immunität zu erkennen. Darüber hinaus lies die Korrelation zu Protein-Regionen mit hoher Mutationslast, die in den derzeit zirkulierenden SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omikron)-Virusstämmen zu finden sind, Spekulationen über den potenziellen Schutz von Individuen gegenüber dieser Virus-Stämme zu. Da keine Hinweise für eine direkte Korrelation von T-Zell-immunogenen Regionen und Mutationsraten gefunden wurden, schlussfolgern wir, dass eine größere Reorganisation des Spike-Proteins notwendig wäre, um eine vollständige Evasion des Virus von der durch Impfung und natürlicher Infektionen mit pre-Omikron Varianten aufgebauten T-Zell-Immunität zu ermöglichen. Diese Hypothese wird zusätzlich durch unsere Analyse der SARS-CoV-2 Omikron-spezifischen T-Zell-Antwort in doppelt und dreifach geimpften Personen gestützt. Hier konnten wir zeigen, dass Bootser-Impfungen, auch wenn sie mit Impfstoffen der ersten Generation durchgeführt wurden, zu einer erhöhten Reaktivität von virusspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führen. Darüber hinaus stieg der Anteil der T-Zell-Antworten gegen nicht mutierte Regionen des SARS-CoV-2 B.1.1.529 mit der dritten Impfung an, was auf einen generellen Nutzen von Auffrischungsimpfungen auch gegen evolvierende Virusstämme hindeutet. Anschließend wollten wir mögliche Ursachen für schwere COVID-19-Infektionen untersuchen. Dafür wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Angeliki Datsi und Prof. Dr. Johannes Fischer vom Universitätsklinikum Düsseldorf die immunogenen Regionen der SARS-CoV-2-Strukturproteine für Individuen, welche HLA-Haplotypen exprimieren, die mit schwereren COVID-19 Krankheitsverläufen assoziiert sind, analysiert. Wir konnten keine Unterschiede in der Fähigkeit, T-Zell Peptide über HLA-Moleküle zu präsentieren, zwischen Individuen mit positiv- oder negativ-assoziierten HLA Haplotypen feststellen. Jedoch fanden wir in Individuen mit generell schwereren COVID-19-Krankheitsverläufen (lange Krankheitsschwere und -dauer) eine geringere Frequenz virus-spezifischer CD8+-T-Zellen, begleitet von einer hohen Bystander-Aktivierung. Individuen mit negativ-assoziierten HLA-Haplotypen, welche sich durch eine länger Krankheitsdauer auszeichnen, zeigenten signifikant erhöhte virusspezifische CD4+ T-Zell Frequenzen, begleitet von erhöhten Titern neutralisierender Antikörper. Wenngleich zielführend, stellt die angewandte Methode eine eher ineffiziente Art zur Analyse von SARS-CoV-2-spezifischen T-Zell-Reaktionen dar. Dies wird hauptsächlich bedingt durch die große Heterogenität des menschlichen HLA-Systems. Deshalb schlagen wir im Zuge dieser Dissertation, eine neue Technologie zur Identifizierung von T-Zell-Epitopen vor: den Multiplex-HLA-Bindungstest. Diese neue Methode ist sensitiv und effizient, durch die Möglichkeit des Multiplexing. Als Proof-of-Concept soll dieser Assay an der Identifizierung von Neoantigenen aus menschlichen Blasenkarzinomen demonstriert werden. Obwohl die Sequenzierungsanalysen noch aussteht, konnten wir die Tumorproben in einzelne Zellsuspensionen zerlegen und die immunphänotypische Zusammensetzung dieser Proben analysieren. Diese zeigte eine variierende und Staging-unabhängige Infiltration des Tumors mit Immunzellen. Die Identifizierung von Neoantigenen aus Blasenkarzinomproben, welche sich durch eine hohe Mutationslast auszeichnen, ist daher von großem Interesse im Hinblick auf eine mögliche Anwendung zellulärer Therapien gerichtet gegen Selbige.

German

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