Poised enhancers are key cis-regulatory elements during ESC differentiation whose activity is facilitated by Polycomb repressive complex 2

Cruz Molina, Sara de la (2017). Poised enhancers are key cis-regulatory elements during ESC differentiation whose activity is facilitated by Polycomb repressive complex 2. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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The developmental transitions occurring during embryogenesis involve spatial and temporal changes in gene expression patterns, which are largely dependent on a group of regulatory elements known as enhancers. Enhancers are short DNA sequences able to positively control the expression of their target genes in a distance and orientation independent manner. Previous studies uncovered a unique set of enhancers in pluripotent embryonic stem cells (ESCs), named “Poised Enhancers”. Poised enhancers are marked by repressive histone marks, like the trimethylation of histone three lysine 27, which is deposited by Polycomb repressive complex 2 (PRC2), and also are bound by co-activators like P300. The fact that poised enhancers display both activating and repressing features as well as evidences indicating that they are associated with genes involved in early organogenesis led us to suggest that these regulatory elements are already bookmarked in ESCs and thus primed for their future activation once the differentiation process starts. However, the functional relevance of poised enhancers and the role of their unique chromatin features remain unknown. To gain insights into these major questions, first, poised enhancers were identified in mouse embryonic stem cells (mESCs) and their activation was evaluated during the establishment of anterior neural identity. Second, using CRISPR/Cas9 technology, poised enhancer candidates were deleted in mESCs, which were then differentiated into anterior neural progenitors. In general, the poised enhancer deletions resulted in severely reduced induction of the poised enhancer’s target genes. Furthermore, circularized chromosome conformation capture coupled to sequencing experiments revealed that poised enhancers and their target genes physically interacted already in ESCs, thus preceding the activation of poised enhancers and their target genes. Interestingly, these poised enhancer-target gene interactions observed in mESCs were found to be PRC2 dependent. Additionally, it was demonstrated that while PRC2 was not necessary to maintain poised enhancers in an inactive state in mESCs, was required for the induction of the poised enhancers’ target genes upon anterior neural differentiation. Finally, poised enhancers were found to frequently reside within a high CpG-dinucleotide genomic context that can directly mediate the recruitment of PRC2. Overall, these findings demonstrate that poised enhancers are essential for the proper expression of the anterior neural developmental program. Importantly, our work illuminates an unexpected function for PRC2 in promoting neural induction. Our data demonstrates that both poised enhancers and their target genes display intrinsic sequence features that can directly mediate PRC2 recruitment. Consequently, PRC2 can bring poised enhancers and their targets into physical proximity already in mESCs, thus providing a permissive regulatory topology that we propose can facilitate the future induction of mayor anterior neural genes.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Die Entwicklungsphasen während der Embryogenese werden durch räumliche und zeitliche Veränderungen in den Genexpressionsmustern bestimmt, die stark von bestimmten Enhancern reguliert werden. Enhancer sind kurze DNA Sequenzen, die in der Lage sind die Expression von Genen unabhängig von Distanz und Orientierung positiv zu beeinflussen. Einige Studien haben bereits eine spezielle ruppe von Enhancern in pluripotenten embryonischen Stammzellen (ESC) identifiziert, die "Poised Enhancers" (PE) genannt werden. PE sind durch repressive Histone-Markierungen, wie z.B., die Trimethylatisierung von Histone-3-Lysine-27 (H3K27me3) gekennzeichnet, welche durch den Polycomb-Repressive-Complex-2 (PRC2) angebracht werden. Gleichzeitig werden sie aber auch durch Co-Aktivatoren wie P300 markiert. Da die PE‘s gleichzeitig aktivierende und repressive Eigenschaften aufweisen und mit bestimmten Genen assoziiert sind, die in der frühen Embryogenese aktiv sind, liegt die Vermutung nahe, dass sie in den ESC vormarkiert werden, um für eine bevorstehende Aktivierung bei einer anstehenden Differenzierung bereit zu sein. Die funktionelle Relevanz der PE‘s und die Rolle ihrer einzigartigen Chromatin Eigenschaften sind bisher noch ungeklärt. Um diese wichtigen Fragen beantworten zu können, wurden in dieser Arbeit zuerst geeignete PE-Kandidaten in Maus-ESC‘s (mESC‘s) identifiziert und ihre Aktivierung während der frühen neuronalen Entwicklung evaluiert. Zweitens, wurden exemplarisch einige PE-Kandidaten mit Hilfe des CRISPR-Cas9- Systems in mESC entfernt, welche anschließend in anteriore neuronale Vorläuferzellen differenziert wurden (AntNPC). Alle hier erzielten Deletionen der PE führten zu einer stark reduzierten Induktion der PE-Zielgene in den AntNPC. Darüber hinaus zeigten 4C-seq-Experimente, dass PE und ihre Zielgene nicht nur in AntNPC, sondern auch in ESC, d.h. vor der Aktivierung der PE und ihrer Zielgene physikalisch interagieren. Interessanterweise konnte auch nachgewiesen werden, dass die Interaktionen der PE mit ihren Zielgenen von PRC2 abhängig sind. Außerdem wurde hier festgestellt, dass PRC2 nicht notwendig ist, um die PE‘s in den mESC inaktiv zu halten, jedoch für die Aktivierung des PE-Zielgens während der AntNPC Differenzierung notwendig ist. Anschließend wurde gezeigt, dass PE‘s oft mit einem hohen CpGdinucleotide Genkontext auftreten, die mit der Rekrutierung von PRC2 in Verbindung stehen. Zusammenfassend zeigen die hier gezeigten Ergebnisse, dass die PE‘s essenziell für eine normale Expression des vorangehenden neuralen Entwicklungsprogramms sind. Die Daten demonstrieren auch, dass beide, die PE und ihre Zielgene, intrinsische Sequenzeigenschaften besitzen, welche die PRC2-Rekrutierung beeinflussen. Dementsprechend kann PRC2 die PE‘s und ihre Zielgene bereits in mESC in physikalische Nähe zueinander bringen und so eine permissive regulatorische Topologie bereitstellen, welche die zukünftige Induktion der anterioren neuronalen Vorläufergene erlaubt.

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