Universität zu Köln

Isokallio, Marita (2017). The source and fate of mitochondrial DNA mutations using high-sensitivity next-generation sequencing technologies. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Pathogenic mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) are known to cause numerous inherited diseases. However, the lack of methods to transgenically manipulate the mtDNA limits the possibilities to learn about mtDNA sequence and function. The mtDNA mutator mouse is used as a saturation mutagenesis model to generate high variant load into mtDNA. With this model, it has been previously shown that, for instance OriL is essential for mtDNA replication or that strong purifying selection of potentially deleterious mtDNA mutations takes place in the germ line. Traditionally, mtDNA mutations have been detected by Sanger sequencing or post-PCR cloning and sequencing, which are unable to represent the entire mtDNA genome, and are laborious, expensive, or of low sensitivity. More recently, high-throughput sequencing methods have been utilized as cheaper approaches to detect mtDNA variants over the entire genome. However, the high error-rate of these technologies is considered as a limiting factor regarding variant detection sensitivity. On the other hand, high-sensitivity high-throughput sequencing methods, such as Duplex Sequencing, are often laborious requiring extensive optimization and high sequencing depth, ultimately raising the costs to a prohibitive level. In this thesis, various mitochondria enrichment and amplification methods are explored in order to enrich mtDNA free from nuclear DNA contamination. Standard Illumina HiSeq sequencing is utilized and data analysis steps are carefully optimized to be suitable for mtDNA genome, which has characteristics very different from the nuclear genome. Finally, the optimized mtDNA enrichment and sequencing protocol, mtDNA-seq, is validated utilizing a titration of spike-in samples harboring known mtDNA variants. With mtDNA-seq it is possible to detect mtDNA variants reliably even below allele frequency of 0.05 %, which is approximately ten times lower variant detection threshold than what has been generally applied in other studies. The optimized mtDNA-seq is applied to address open mitochondrial biology research questions. The variant profile of the entire mtDNA genome is generated, and several complete mutational coldspots are discovered at the control region of the mtDNA. These novel coldspots are hypothesized to be potential regulation sites for mtDNA replication and replication-associated transcription by as-yet-unknown molecular mechanisms. To clarify the developmental stage and mechanism of purifying selection, hemizygote mtDNA mutator mouse is utilized to isolate mtDNA variants into female lineages. As it is possible to detect extremely rare mtDNA variants by mtDNA‑seq, these new results expand the previous study showing strong purifying selection by N2 generation of mice. The results suggest that by chance any mtDNA variant may be transmitted to the offspring, however, the most deleterious mutations do not seem to clonally expand even in N1 generation mice. To understand the mtRNA processing, amplicon sequencing approach is utilized in a preliminary study. The aim in this study is to detect allelic mismatches between mtDNA and mtRNA variants, which potentially indicate mtRNA processing defects.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Pathogene Mutationen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind dafür bekannt, mehrere Erbkrankheiten zu verursachen. Aufgrund fehlender Methoden zur transgenen Manipulation der mtDNA ist es kaum möglich, die mtDNA Sequenzen und Funktionen zu untersuchen. Die mtDNA-Mutator-Maus wird als Sättigungsmutagenese-Modell verwendet, um eine hohe Variantenbelastung innerhalb der mtDNA zu erzeugen. Bisher wurde bei diesem Modell gezeigt, dass der OriL essentiell für die mtDNA-Replikation ist und dass eine starke negative Selektion potentiell schädlicher mtDNA-Mutationen in der Keimbahn stattfindet. Traditionell wurden mtDNA-Mutationen anhand von Sanger-Sequenzierung oder Post-PCR-Klonierung und Sequenzierung nachgewiesen. Diese Methoden können allerdings nicht das gesamte mtDNA-Genom darstellen. Zudem sind sie aufwendig, teuer und nicht sensibel genug. Seit einigen Jahren werden Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren als billigere Ansätze verwendet, um mtDNA-Varianten über das gesamte Genom zu detektieren. Allerdings werden diese, wegen ihrer hohen Fehlerrate, als ungeignet zum Detektieren von Varianten angesehen. Im Gegensatz dazu sind empfindlichere Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden wie Duplex-Sequenzierung mit einem hohen Arbeitsaufwand verbunden, da sie eine umfangreiche Optimierung und eine hohe Sequenzierungstiefe erfordern. Dadurch erhöhen sich die Kosten auf ein unerschwingliches Niveau. In dieser Arbeit werden verschiedene Mitochondrienanreicherungs- und Amplifikations-methoden untersucht, um mtDNA frei von nuklearer DNA-Kontamination anzureichern. Es wird eine Standard Illumina HiSeq Sequenzierung genutzt. Die Datenanalyse wird sorgfältig für das mtDNA-Genom optimiert, da dessen Eigenschaften sich von denen des Kerngenoms unterscheiden. Schließlich wird das optimierte mtDNA-Anreicherungs- und Sequenzierungs-protokoll, mtDNA-seq, unter Verwendung einer Titration von Spike-In Proben, welche bekannte mtDNA-Varianten besitzen, validiert. Mit mtDNA-seq ist es möglich, mtDNA-Varianten zuverlässig zu detektieren. MtDNA detektiert sogar Mutationen unterhalb einer Allelfrequenz von 0,05%. Dies ist etwa zehnmal niedrigerer als die allgemein angewandte Varianten-Nachweisgrenze. Die optimierte mtDNA-seq wird angewendet, um noch offene mitochondriale Probleme zu adressieren. Es wird das Variantenprofil des gesamten mtDNA-Genoms erzeugt, wodurch mehrere komplette Mutations-Coldspots innerhalb von Kontrollbereichen der mtDNA entdeckt werden. Diese bisher unbeschriebenen Coldspots könnten potenzielle Regulationsorte für die mtDNA-Replikation und die replikations-assoziierte Transkription sein. Die molekulare Mechanismen hierfür sind bisher ebenfalls unbekannt. Zur Untersuchung der Entwicklungs-stufen und des Mechanismus der negativen Selektion wird die hemizygote mtDNA-Mutator-Maus verwendet, um mtDNA-Varianten in weibliche Linien zu isolieren. Da mtDNA-seq die Detektion extrem seltener mtDNA-Varianten ermöglicht, können neue Ergebnisse gewonnen werden, welche den bisherigen Wissensstand zur starken negativen Selektion in der N2-Generation von Mäusen erweitern. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass jede mtDNA-Variante zufällig auf die Nachkommen übertragen werden kann. Jedoch scheinen sich die schädlichsten Mutationen nicht klonal auszubreiten, nicht einmal in N1-Generation. Um die mtRNA-Verarbeitung zu verstehen, wird in einer Pilotstudie der amplicon-Sequenzierungsansatz verwendet. Ziel dieser Studie ist es, Allel-Mismatches zwischen mtDNA und mtRNA-Varianten zu detektieren und dadurch auf mögliche mtRNA-Verarbeitungsdefekte hinzuweisen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Isokallio, Marita marita.isokallio@age.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-79419
Date:	15 December 2017
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language mitochondrial DNA UNSPECIFIED rare variant detection UNSPECIFIED
Date of oral exam:	14 December 2017
Referee:	Name Academic Title Valenzano, Dario Dr. Beyer, Andreas Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/7941