Universität zu Köln

Lorenz, Jessica Sophie (2018). DNA-based biomimetics as modular tools to study reconstituted and cellular systems. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Deoxyribonucleic acid (DNA) is the fundamental basis of virtually all living organisms. The central dogma in molecular biology refers to DNA as the carrier of the genetic information that is first being transcribed into ribonucleic acids (RNA) and further translated into proteins. This dogma has been refined, as nucleic acids were also discovered to act as structural and regulatory components within cells. In recent years, the new research field DNA nanotechnology emerged, in which DNA is used as a molecular building block, whose predictable base pairing allows the fabrication of self-assembled two- and three dimensional (2D and 3D) DNA nanostructures, which moreover can be spatially functionalized with a broad range of biomolecules on the nanometer scale. This unique feature as well as its versatility, biodegradability and low toxicity has led to great interest for various applications in a wide range of areas. Moreover, the design of DNA-based biomimetic systems has emerged as a valuable tool for systematically exploring the complexity of cells, which is also at the center of the work shown here. In the course of this work, short functional peptides were covalently attached to wire-frame DNA nanostructures as well as simple three-arm branched DNA junctions and double-stranded (ds) DNA. In a first approach, DNA tetrahedra and DNA trimers were covalently coupled to cell-penetrating peptides (CPP), which mediated a more efficient cellular uptake. Thus, it can be assumed that CPP retain their function, even when they are covalently attached to DNA, which was one of the main questions within this thesis. The second approach, comprising the main part of this dissertation, focused on the generation and in vitro characterization of the impact of synthetic actin crosslinkers on both reconstituted actin networks and cells. The precise regulation of structural and, thus, mechanical properties of living cells is essential for functionalities such as motility, stability and shape. These properties are mainly attributed to the cytoskeleton, whose main constituents are semiflexible actin filaments as well as numerous actin-binding proteins (ABP), which organize the filaments into a variety of higher order structures, e.g. networks and bundles. ABP that form transient, physical crosslinks between filaments, due to their empirical nature and complexity, do not allow straightforward, systemic studies in which different key parameters can be altered independently. To overcome this limitation, naturally occurring actin crosslinkers such as α-actinin and fascin were mimicked by synthetically fabricated crosslinkers based on DNA and peptides. These were generated through the covalent attachment of actin-binding peptides on both sides of a double-stranded DNA spacer and thus solely differed in their affinity towards filamentous actin. Bulk shear rheology experiments on reconstituted actin networks revealed that both, the weakly-binding LifeAct® crosslinker (wLX) and the strongly-binding Phalloidin crosslinker (sPX) generated the same characteristic mechanical fingerprint as the natural crosslinkers α-actinin and fascin, respectively. Moreover, they showed a concentration-dependent impact on different structural morphologies of actin networks as well as an inhibition of actin polymerization. Interestingly, these synthetic crosslinkers also interfered with intracellular systems, as crosslinker-treated cells showed several altered behaviors. Actin remodeling dynamics, as well as migration and invasion were reduced, whereas proliferation and apoptosis rates were not affected. Additionally, synthetic crosslinkers possibly impact the process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), in which cells lose their epithelial properties and become transformed into cells with enhanced motile and invasive functions. This process comprises complex signal transduction pathways, which also depend upon the polymerization and depolymerization status of actin. A typical signature of EMT, the formation of actin criss-cross stress fibers, was suppressed in wLX-treated, EMT-induced cells, which could also be correlated to results of advanced cell mechanical measurements. However, the exact mechanism of how synthetic crosslinkers affect cellular functions still remains unclear. Further investigations are required to reveal the underlying cause, and furthermore whether they suppress EMT, in which case they could become a potential candidate for the treatment of, for instance, ocular fibrosis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Desoxyribonukleinsäure (DNA) stellt die fundamentale Grundlage praktisch aller lebenden Organismen dar. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie bezieht sich auf DNA als Träger der genetischen Information, die zunächst in Ribonukleinsäuren (RNA) transkribiert und anschließend in Proteine translatiert wird. Da Nukleinsäuren ebenfalls als strukturelle und regulatorische Komponenten innerhalb von Zellen wirken, wurde dieses Dogma überdacht. So entstand in den letzten Jahren das neue Forschungsfeld „DNA-Nanotechnologie“, welches DNA als molekularen Baustein nutzt. Die vorhersehbare Basenpaarung ermöglicht die Herstellung selbstorganisierter zwei- und dreidimensionaler (2D und 3D) Nanostrukturen, welche zusätzlich mit einer Vielzahl verschiedener Biomoleküle im Nanometer-Maßstab funktionalisiert werden können. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaft sowie der Vielseitigkeit, geringen Toxizität und biologischen Abbaubarkeit, fanden DNA-Strukturen verschiedene Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen. Darüber hinaus hat sich das Design DNA-basierter, biomimetischer Systeme als ein wertvolles Instrument zur systematischen Erforschung der Komplexität von Zellen erwiesen, welches ebenfalls im Mittelpunkt der hier gezeigten Arbeit steht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden kurze funktionelle Peptide kovalent an DNA-Nanostrukturen gebunden. In einem ersten Ansatz wurden DNA-Tetraeder und DNA-Trimere kovalent an zellpenetrierende Peptide (CPP) gekoppelt, welche eine effizientere zelluläre Aufnahme vermittelten. Der zweite Ansatz, welcher den Großteil dieser Dissertation umfasst, konzentrierte sich auf die Generierung und in vitro-Charakterisierung des Einflusses synthetischer Aktin-Crosslinker sowohl auf rekonstituierte Aktinnetzwerke als auch auf Zellen. Die genaue Regulation struktureller und dadurch mechanischer Eigenschaften lebender Zellen ist essentiell für Funktionalitäten wie Motilität, Stabilität und Form. Diese Eigenschaften werden hauptsächlich dem Zytoskelett zugeschrieben, dessen Hauptbestandteile semiflexible Aktinfilamente sowie zahlreiche Aktin-bindende Proteine (ABP) sind, welche die Filamente in eine Vielzahl von Strukturen höherer Ordnung, wie z.B. Netzwerke oder Bündel, organisieren. ABP, die transiente, physikalische Vernetzungen zwischen Filamenten bilden, erlauben aufgrund ihrer empirischen Natur und Komplexität keine direkten systemischen Studien, in denen verschiedene Schlüsselparameter unabhängig voneinander verändert werden können. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden natürlich vorkommende Aktin-Crosslinker, wie α-Actinin und Fascin, durch DNA- und Peptid-basierte, synthetisch hergestellte Crosslinker nachgeahmt. Diese wurden durch die kovalente Bindung Aktin-bindender Peptide an beiden Seiten eines doppelsträngigen DNA-Spacers erzeugt und unterschieden sich daher nur in ihrer Affinität gegenüber filamentösem Aktin. Rheologische Untersuchungen rekonstituierter Aktin-Netzwerke zeigten, dass sowohl der schwach bindende LifeAct®-Crosslinker (wLX) als auch der stark bindende Phalloidin-Crosslinker (sPX) den gleichen charakteristischen mechanischen Fingerabdruck wie die natürlichen Crosslinker α-Actinin bzw. Fascin erzeugen. Darüber hinaus zeigten sie einen konzentrationsabhängigen Einfluss auf Struktur-morphologien von Aktin-Netzwerken sowie eine Hemmung der Aktin-Polymerisation. Interessanterweise interferierten synthetische Crosslinker ebenfalls mit intrazellulären Systemen und es zeigte sich, dass Crosslinker-behandelte Zellen einige veränderte Verhaltensweisen aufwiesen. Sowohl die Aktin-Remodellierungsdynamik als auch die Migration und Invasion waren reduziert, während Proliferations- und Apoptoseraten nicht beeinflusst wurden. Darüber hinaus beeinflussen synthetische Crosslinker möglicherweise den Prozess des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), wobei Zellen ihre epithelialen Eigenschaften verlieren und in Zellen mit mesenchymalen Charakteristika, u.a. einer erhöhten Invasivität, transformiert werden. Dieser Prozess umfasst komplexe Signaltransduktionswege, die von der Polymerisations- und Depolymerisationsdynamik von Aktin abhängen. EMT-induzierte Zellen, welche vorab mit wLX behandelt wurden, unterdrückten die Bildung charakteristischer Stressfasern, welche ein typisches Merkmal von EMT darstellen. Dies korrelierte zusätzlich mit Ergebnissen durchgeführter zellmechanischer Untersuchungen. Mit welchem Mechanismus die synthetischen Crosslinker zelluläre Funktionen beeinflussen, bleibt jedoch unklar. Um die zugrundeliegende Ursachen aufzudecken, sind fortführende Untersuchungen erforderlich. Dies umfasst ebenfalls eine potentielle Inhibierung von EMT, in welchem Fall synthetische Crosslinker zukünftig möglicherweise für die Behandlung von Fibrosen, z.B. im Auge, eingesetzt werden könnten. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Lorenz, Jessica Sophie jessica.lorenz@izi.fraunhofer.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-79832
Date:	17 January 2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Chemistry and allied sciences Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language biomimetic materials, biopolymers, crosslinkers, DNA nanotechnology, molecular designs English
Date of oral exam:	12 January 2018
Referee:	Name Academic Title Neundorf, Ines Prof. Dr. Niefind, Karsten Prof. Dr. Smith, David Michael Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/7983