Universität zu Köln

Wozny, Dorothee Charlotte (2017). Identification and Characterization of Seed Longevity Genes in Barley (Hordeum vulgare). PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Plant diversity is being lost at an unprecedented rate. This makes the conservation of plant species to a global task of high priority. Seed conservation, both in situ and ex situ, is one of the best strategies for the conservation of plant diversity. For germplasm preservation in seed banks, seed longevity is of particular importance. Seed longevity constitutes a measure for the period a seed remains viable when stored under the optimum conditions for that species and/or cultivar. Seed longevity is induced during seed maturation and is involved in retaining germination ability that is gradually lost as a result of ageing. Hence, seed longevity is a major parameter controlling seed quality and an important survival trait in the soil seed bank helping the seed to adapt to changing environmental conditions. Until now, little is known about the genetic basis of differences in seed longevity because this trait is affected by numerous environmental effects during seed formation, harvest, and storage, and genetic variation between and within species is probably controlled by several genes. The work presented in this thesis aims to identify and characterize seed longevity loci/genes in barley (Hordeum vulgare) by combining a quantitative genetics approach with 'omics' technologies. This work is based on a previous Quantitative Trait Loci (QTL) study in recombinant inbred lines (RILs), derived from the short-lived Ethiopian spring barley landrace L94 and the long-lived Argentinian spring barley landrace Cebada Capa (CC). In total, four putative QTLs for seed longevity were identified on chromosomes 1 and 2, and near isogenic lines (NILs) were generated (Adimargono et al., in preparation). Using these near isogenic lines, the four putative QTLs could be confirmed and further mapping of Cebada Capa introgressions was achieved in the so-called L94 NILs using RNA-seq. For candidate and downstream target gene identification, a combined transcriptome and proteome analysis was performed. The analysis of mature, non-aged seeds of the two parental lines and the L94 NILs by RNA-seq and total seed proteomic profiling identified two putative candidate genes and one possible downstream target gene. The (NADP)-dependent Malic Enzyme (NADP-ME) AK248526.1 and the UDP-glycosyltransferase MLOC_11661.1 were chosen as possible candidate genes for two of the four seed longevity QTLs, while the second NADP-ME MLOC_35785.1 was chosen as a possible downstream target. To validate these putative candidate and downstream target genes, a T-DNA knock-out line of a homologous Arabidopsis gene, shown to have a seed longevity phenotype by Nguyen (2014), was complemented with the respective Cebada Capa and L94 alleles under the expression of different promoters. Both the NADP-ME MLOC_35785.1 and the UDP-glycosyltransferase MLOC_11661.1 were able to rescue the nadp-me1 seed longevity phenotype when being expressed under the control of the 35S- or the Ubi-promoter. In the latter case, only the CC-specific coding sequence had an effect. Since the identified candidate NADP-ME MLOC_35785.1 may affect the redox status in normal and deteriorating seeds, the corresponding Arabidopsis mutant nadp-me1 was combined with the redox reporter roGFP2 to visualize the redox potential in seeds using confocal microscopy. First transformant generation (T1) lines, showing strong fluorescence in the cytosol, could be generated in this study and allow the measurement of the NADP+/NADPH redox potential in future studies.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Pflanzenvielfalt nimmt in einem bislang noch nicht da gewesenen Ausmaß ab. Aufgrund dessen stellt der Erhalt von Pflanzenarten eine globale Aufgabe von hoher Priorität dar. Samenkonservierung, sowohl in situ als auch ex situ, stellt eine der besten Strategien zum Erhalt der Pflanzenvielfalt dar. Für den Erhalt von Keimgewebe ist die Samenlanglebigkeit besonders wichtig. Die Samenlanglebigkeit stellt ein Maß für diejenige Zeitspanne dar, in der der Samen, unter den optimalen Bedingungen für die Art oder Sorte gelagert, lebensfähig ist. Die Samenlanglebigkeit wird während der Samenreife induziert und ist am Erhalt der Keimungsfähigkeit beteiligt, die graduell aufgrund des Alterungsprozesses verloren geht. Somit ist die Samenlanglebigkeit eine Hauptkomponente der Samenqualität und auch ein wichtiges Überlebensmerkmal der Samenbank in der Erde, da sie dem Samen hilft, sich an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Bis jetzt ist wenig über die genetische Grundlage der beobachteten Unterschiede in der Samenlanglebigkeit bekannt, da dieses Merkmal von einer Reihe von Umwelteinwirkungen während der Samenbildung, der Ernte und der Lagerung beinflusst wird. Die genetische Variation zwischen und innerhalb von Pflanzenarten wird zudem von mehreren Genen kontrolliert. Die vorliegende Doktorarbeit hatte das Ziel Samenlanglebigkeits-Loci und Gene in Gerste (Hordeum vulgare) anhand der Kombination von quantitativer Genetik und 'omics'-Technologien zu identifieren und zu charakterisieren. Diese Arbeit basiert auf einer frühreren Quantitative Trait Locus (QTL)-Studie in rekombinanten Inzuchtlinien (RILs), die von der Kreuzung der kurzlebigen äthiopischen Gerstenrasse L94 mit der langlebigen argentinischen Gerstenrasse Cebada Capa (CC) stammen. Insgesamt wurden vier mutmaßliche Samenlanglebigkeits-QTLs auf den Chromsomen 1 und 2 identifiert und nahezu isogene Linien (NILs) generiert (Adimargono et al., in Vorbereitung). Mithilfe dieser nahezu isogenen Linien konnten die vier mutmaßlichen QTLs bestätigt werden und die Kartierung von CC-Introgressionen in den so genannten L94 NILs mithilfe von RNA-seq erreicht werden. Zur Identifizierung von Kandidatengenen und nachgeschalteten Genen wurde eine kombinierte Transkriptom- und Proteomanalyse durchgeführt. Die Analyse von reifen, nicht gealterten Samen der zwei Elternlinien und der L94 NILs mittels RNA-seq und Proteomanalyse führte zur Identifizierung von zwei möglichen Kandidatengenen und einem möglichen nachgeschalteten Gen. Das NADP-abhängige Malatenzym (NADP-ME) AK248526.1 und die UDP-Glykosyltransferase MLOC_11661.1 wurden als mögliche Kandidatengene für zwei der vier Samenlanglebigkeits-QTLs ausgewählt. Das zweite NADP-ME MLOC_35785.1 wurde als mögliches nachgeschaltetes Gen ausgewählt. Für die Validierung dieser Kandidatengene und nachgeschalteten Gene wurde eine T-DNA knock-out-Linie eines homologen Arabidopsis-Gens, die einen Samenlanglebigkeitsphänotyp zeigte (Nguyen, 2014), mit den entsprechenen Cebada Capa und L94 Allelen unter der Kontrollen von verschiedenen Promotoren komplementiert. Sowohl das NADP-ME MLOC_35785.1 als auch die UDP-Glykosyltransferase MLOC_11661.1 konnten den Samenlanglebigkeitsphänotyp von nadp-me1 aufheben/retten, wenn sie unter dem 35S- und Ubi-Promotor exprimiert wurden. Im letzten Fall hatte nur die CC-spezifische Kodierungssequenz einen Effekt. Da das identifizierte NADP-ME MLOC_35785.1 den Redoxstatus in normalen und alternden Samen beeinflussen könnte, wurde die entsprechende Arabidopsis-Mutante nadp-me1 mit dem Redoxreporter roGFP2 kombiniert, um das Redoxpotental in Samen mithilfe von Konfokalmikroskopie visualisieren zu können. Transformanten der ersten Generation (T1), die ein starkes Fluoreszenzsignal im Zytosol zeigen, konnten in dieser Arbeit generiert werden und ermöglichen die Messung des NADP+/NADPH-Redoxpotentials in zukünftigen Studien. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Wozny, Dorothee Charlotte dorothee_wozny@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-80054
Date:	15 December 2017
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Technology (Applied sciences)
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language PhD thesis, Genetics, Barley, Arabidopsis, Near Isogenic Lines, Seed longevity, QTL mapping, Identification of Seed longevity genes,omics Approaches, RNA-Seq, Proteomics, Metabolomics English
Date of oral exam:	26 April 2017
Referee:	Name Academic Title Werr, Wolfgang Prof. Dr. Hülskamp, Martin Prof. Dr. Koornneef, Maarten Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8005