Ist Ergothionein der physiologische Singulett-Sauerstoff-Quencher? Analyse des Ergothioneinschutzes in 293 Zellen und Identifizierung der in vitro Reaktionsprodukte

Stoffels, Christopher (2018). Ist Ergothionein der physiologische Singulett-Sauerstoff-Quencher? Analyse des Ergothioneinschutzes in 293 Zellen und Identifizierung der in vitro Reaktionsprodukte. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
Dissertation_von_Christopher_Stoffels.pdf - Accepted Version
Download (5MB)

Abstract

Mit Hilfe der Photosensibilisatoren (PST) ReAsH, Bengal Rosa und TMPyP konnte eindeutig die Singulett Sauerstoff (1O2) schützende Wirkung von Ergothionein (ET) in 293 Zellen gezeigt werden. Dabei entstand bis zu 58% weniger Methionin Sulfoxid (MSO) in Zellen mit ET, welches mittels Massenspektrometrie gemessen wurde. MSO ist ein Indikatormolekül für reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Die gewählten PST generieren hauptsächlich 1O2, aber auch andere ROS, wie Hydroxyl Radikale, Wasserstoffperoxid oder Superoxidanion. Deswegen kann nicht geschlussfolgert werden, dass ET spezifisch vor 1O2 schützt. Um dies zu untersuchen wurden Experimente mit dem 1O2 generierenden Endoperoxid, DHPNO2, durchgeführt. Diese waren nicht reproduzierbar. Der Versuch 1O2 Spezifität in das PST System mit TEMPO als selektiven 1O2 Indikator zu bringen, konnte nicht erbracht werden. Bemühungen, das DHPNO2 System durch Hintergrundminimierung reproduzierbarer zu gestalten, schlugen fehl. Hierfür wurde versucht die Antioxidantien Ascorbinsäure und Glutathion (GSH) zu minimieren. Für GSH war dies eindrucksvoll gelungen. Intrazelluläres GSH konnte zu 98% minimiert werden. Durch die Methode der intrazellulären GSH Minimierung konnte ein Vergleich des 1O2 Quenchverhaltens von ET und GSH in 293 Zellen durchgeführt werden. Dabei schützt ET eindeutig besser vor 1O2 Stress als GSH. Beeindruckender ist sogar, dass in Zellen mit ET die Anwesenheit von GSH keinen weiteren Schutzeffekt gegenüber 1O2 hervorbrachte. Erst in Abwesenheit von ET zeigt sich ein 1O2 Schutzeffekt von GSH. Nachdem der ET Schutzeffekt gegenüber 1O2 intrazellulär gezeigt wurde, schlossen massenspektrometrische in vitro Untersuchung zum Reaktionsmechanismus an. Dafür wurde 1O2 mit ET und Hercynin (HER; ET ohne Schwefel) analysiert. Dabei zeigten sich fundamentale Unterschiede. Während HER und anderen Imidazole über eine [4+2] Cycloaddition reagieren, kann ET, wegen des doppelt gebundenen Schwefels, diesen Weg nicht bestreiten. ET reagiert über [2+2] Cycloaddition zum Intermediat 4,5 Dioxetan und über Schenck En Reaktion zu Hydroperoxiden an Position 4 oder 5 des Imidazolrings. Die Generierung der ET spezifischen Produkte war resistent gegenüber einem großen Überschuss an TRIS und GSH, aber nicht die von HER. ET favorisiert 1O2 mindestens 50 fach mehr als GSH und mindestens 250 fach mehr als TRIS für die initiale Reaktion. Der Verlust von ET war nahe vollständig unterdrückt in 5 mM GSH, aber nicht in 25 mM TRIS. Angerfertigte Fragmentierungsmuster geben Hinweise auf einen Regenerationsmechanismus, da einige ET Produkte leicht zerfallen und zu stabilen Aromaten werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Experiments with the photosensitizers (PST) ReAsH, Bengal Rosa and TMPyP clearly demonstrated that ergothioneine (ET) in 293 cells protect against singlet oxygen (1O2) stress. This resulted in up to 58% less methionine sulfoxide (MSO) in cells with ET measured via mass spectrometry (MS). MSO is an indicator molecule for reactive oxygen species (ROS). The selected PST mainly generate 1O2, but also other ROS, such as hydroxyl radicals, hydrogen peroxide or superoxide anion. Therefore, it cannot be ruled out that ET is only responsible for the protection against 1O2. Thus, experiments were carried out with the endoperoxide, DHPNO2, which specifically generates 1O2. These results were not reproducible. Furthermore, it could not be achieved to generate 1O2 specifity with the 1O2 indicator TEMPO. TEMP is oxidized merely by 1O2 to TEMPO. Efforts to make the DHPNO2 system more reproducible through background minimization of 1O2 quenchers have failed. An attempt was made to minimize the antioxidants ascorbic acid and glutathione (GSH). For GSH this was impressively successful. Intracellular GSH could be minimized to 98%. The method of intracellular GSH minimization allowed a comparison of the 1O2 quench behavior of ET and GSH in 293 cells. ET is a more effective 1O2 quencher than GSH, which is shown by cells with ET and GSH, whereby no further protection against 1O2 was observed in comparison to cells without GSH. Only in the absence of ET GSH has a 1O2 protective effect. After the ET protection effect against 1O2 was shown intracellular, in vitro experiments were performed to analyze the reaction mechanism of ET with 1O2 via MS. Therefore, 1O2 was tested with ET and hercynine (HER; ET without sulfur). The results show fundamental differences between ET and HER. While HER and other imidazoles react via a [4 + 2] cycloaddition, ET cannot use this pathway because of its double-bonded sulfur. ET possibly reacts to the intermediate 4,5 dioxetane via [2 + 2] cycloaddition or via Schenck ene reaction to a hydroperoxide at position 4 or 5 of the imidazole ring. The generation of ET-specific products is resistant to a large excess of TRIS and GSH, but the hercynine products are not. ET favors 1O2 at least 50 fold more than GSH and at least 250 fold more than TRIS for the initial reaction. The loss of ET was nearly completely suppressed in 5 mM GSH but not in 25 mM TRIS. Prepared fragmentation patterns indicate a regeneration mechanism, as some ET products readily disintegrate and become stable aromates.

English

Creators: