Universität zu Köln

Brant, Lilija (2018). Exploiting native forces to capture chromosome conformation in mammalian cell nuclei. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mammalian cells contain the same 2 m-long DNA molecule, but different cell fates imply different three-dimensional genome organization that is tightly linked to gene expression and other cellular functions. This can range from shorter-range chromatin looping between genomic elements such as promoters and enhancers to higher-order folding of whole chromosomes within the confines of cell nuclei. In the past two decades, our understanding of this complex genome architecture and its underlying functions has been advanced through microscopy studies and chromosome conformation capture (3C) techniques. Fixation of the spatial chromatin network relies on cell cross-linking using formaldehyde and is a major experimental component of most molecular biological methods, including 3C-based approaches. However, this step remains a ‘black box’ since it may introduce biases that may skew the resulting data. In fact, such skewing between microscopy and 3C-derived data was recently reported. Here, we address these concerns and provide a novel intrinsic chromosome conformation capture assay (i3C), which allows determination of spatial chromatin interactions without the need for cell cross-linking. We handle mammalian cell nuclei in a close-to-physiological buffer that exploits native forces, such as transcription, to preserve nuclear chromatin folding. We introduce different variations of our intrinsic method that enable us to investigate locus-specific to genome-wide interactions between DNA segments. Using distinct cell lines and chromatin characteristics of the examined loci, we show that most of the native contact signals resemble cross-linked ones and reside within the constraints of topological associated domains (TADs). However, i3C-based tools increase the signal-to-noise ratio and enhance precision of contact determination at regulatory elements and CTCF sites. Moreover, we observed differential contacts by intrinsic techniques and developed an orthogonal validation method called ‘TALE-iD’. Finally, we utilized extracellular signaling by the tumor necrosis factor-α to track pre-established and dynamic chromatin looping. Our findings suggest that cross-linking of chromatin may mask such fine-tuned and temporal-specific dynamics of three-dimensional genome organization. Taken together, intrinsic chromosome conformation capture assays improve our understanding of the true nature of chromatin folding stabilization and shed light on the relevance of native forces on nuclear architecture.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Die Analyse der nativen Chromosomenkonformation in Säugertierzellkernen German
Translated abstract:	Abstract Language Säugetierzellen beinhalten dasselbe 2-Meter lange DNA Molekül, dessen drei-dimensionale Faltung im Zellkern eng mit der Genexpression verknüpft ist und daher während der Differenzierung einer Zelle variiert. Der strukturelle Aufbau des Chromatins beinhaltet spezifische Kontakte zwischen genomischen Elementen wie Promotoren und Enhancer, welche eine Windung des DNA-Moleküls erzeugen, bis hin zu komplexen Faltungsmechanismen von ganzen Chromosomen. Während den letzten zwei Jahrzehnten wurde unser Verständnis über die vielschichtige Architektur des Genoms und dessen einhergehende Funktion dank Mikroskopie- und Chromosomkonformations-Studien (3C) erheblich verbessert. Die Fixierung von Zellen und damit des räumlichen Chromatinnetzwerkes basiert auf der Verwendung von Formaldehyd. Dieses ist Hauptbestandteil von vielen molekularbiologischen Methoden, unter anderem auch konventionelle Chromosomkonformations Techniken. Allerdings kann die Effizienz und Spezifität von chemischer Zellfixierung fehlerhaft sein und somit Ergebnisse beinträchtigen, wodurch diese Methode eine bislang wenig charakterisierte „Black Box“ darstellt. Die vorliegende Arbeit stellt eine neue, intrinsische Methode (i3C) zur Analyse von nativen Chromatinstrukturen vor, welche nicht auf einer Fixierung mittels Formaldehyd basiert. Dazu behandeln wir Säugetierzellkerne in einem speziellen, physiologischen Puffer, in welchem die Transkription und somit auch die nukleare, drei-dimensionale Faltung des Chromatins erhalten bleiben. Anhand unterschiedlicher Zelllinien und Chromatincharakteristika können wir belegen, dass zahlreiche ähnelnde DNA-Kontakte mittels nativen als auch konventionellen Chromosomkonformationsmethoden detektiert werden und diese sich in separierten Strukturen, auch bekannt als topologisch assoziierte Domänen (TAD), befinden. Außerdem ermitteln wir mittels i3C-Methoden Chromatinkontakte, welche vorallem mit regulatorischen Elementen und CTCF-Regionen assoziiert werden, präzise und mit einer verbesserten Signalrate. Desweiteren haben wir unter nativen Bedingungen Kontaktunterschiede festgestellt und zur Verifizierung dieser eine neue unabhängige Methode namens „TALE-iD“ entwickelt. Abschließend haben wir den extrazellulären Signalweg von dem Tumornekrosefaktor-α stimuliert und die damit zusammenhängenden dynamischen sowie vorher festgesetzten Chromatinstrukturen analysiert. Dabei haben wir festgestellt, dass die chemische Zellfixierung die feinen Veränderungen des drei-dimensionalen Chromatinnetzwerkes verbergen kann. Daraus schlussfolgern wir, dass unsere intrinsische Chromosomkonformationstechnik unser Verständnis von natürlichen Einwirkungen zur Stabilisierung des nativen Chromatinnetzwerkes in weiterführenden Versuchen verbessern kann. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Brant, Lilija lilijabrant@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-80787
Date:	February 2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Chromsome conformation capture English
Date of oral exam:	13 November 2017
Referee:	Name Academic Title Schumacher, Björn Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8078