Identification and functional characterization of BICD2 mutations causing SMALED2, a congenital dominant form of spinal muscular atrophy

Martinez Carrera, Lilian Andrea (2017). Identification and functional characterization of BICD2 mutations causing SMALED2, a congenital dominant form of spinal muscular atrophy. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Autosomal dominant spinal muscular atrophy is considered rare in comparison with the recessive 5q-linked form. However, for the majority of autosomal dominant SMA, the genetic causes are unknown. In this respect, the present doctoral thesis focused on the identification and functional characterization of the disease-causing gene of autosomal dominant spinal muscular atrophy, lower extremity-predominant, type 2 (SMALED2 MIM 615290). By applying next generation sequencing and Sanger sequencing, we were able to identify in affected individuals with SMALED2, four heterozygous missense variants (c.320C>T [p.Ser107Leu], c.563A>C [p.Asn188Thr], c.2108C>T [p.Thr703Met] and c.2239C>T [p.Arg747Cys]) in the Bicaudal-D2 gene (BICD2 MIM 609797). Moreover, to gain insights into the pathogenesis of SMALED2, the molecular consequences of these protein alterations were further investigated using in vitro and in vivo approaches. BICD2 is a highly conserved protein and interacts with several important players involved in axonal transport (dynein-dynactin complex [DTCN2] and kinesin [KIF5A]), endocytosis (clathrin heavy chain), vesicle transport (RAB6A) and others. BICD2 has been implicated in retrograde dynein-mediated axonal transport along the microtubules, in the vesicle transport from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum and in the centrosome positioning. Our in vitro studies revealed that each of the SMALED2-associated mutations exerts different consequences in the cell, including Golgi fragmentation, changes in interaction with dynein-dynactin complex and RAB6A, decreased endocytosis, centrosome splitting and G2 phase arrest, and aggregate formation. Studies performed in fibroblast cell lines derived from individuals with SMALED2 showed that all the mutations cause microtubule hyperstability. Clinical findings of affected individuals suggest that the motor neuron is the disease relevant cell type in SMALED2. Transduced motor neurons that express the SMALED2-associated mutations displayed axonal aberrations such as increased branching and overgrowth. Both findings, microtubule hyperstability and axonal aberrations during development, strongly suggest an involvement of BICD2 either in formation, stability or assembly of microtubules. Thus, our data points to a novel function of BICD2 in microtubule regulation, that when altered constitutes a shared pathomechanism of SMALED2-associated mutations, while the disease severity may be defined by individual effects of a respective mutation. We generated and characterized the first in vivo model for SMALED2. We made use of the bioengineered tools of Drosophila melanogaster, a widely used animal system in studies of neurodevelopmental disorders. The Drosophila lines that expressed in neuronal tissue the mutant BICD2 constructs showed markedly impaired locomotion during early adulthood with reduced neuromuscular junction size during development. No pathological effect was observed when expressing the mutations in muscle, which supports a primarily neurogenic involvement, as reported by clinicians in SMALED2 cases. The mutations studied in the Drosophila model for SMALED2, were identified in individuals with chronic myopathy. This finding opened up a controversial debate of whether those mutations affect primarily neurons or muscles. Histological and functional studies revealed that these BICD2 mutations alter Golgi structure in muscle and possibly exocytosis. In addition, one asymptomatic carrier was identified suggesting variable expressivity or incomplete penetrance, possibly due to the presence of protective genetic modifiers. Unexpectedly, our study unraveled an early lethal form of congenital arthrogryposis multiplex with respiratory failure associated to de novo variants in BICD2. The extreme pathological consequences due to these mutations may lead to the uncovering of a likely different mechanism as the observed in SMALED2. Thus, the investigations carried out during this PhD project led to the discovery of BICD2 as the genetic cause of SMALED2, provided substantial experimental evidence of the pathological effects due to BICD2 mutations, and contributed to the identification of other disorders associated to BICD2.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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Autosomal dominante spinale Muskelatrophie tritt im Vergleich zu 5q-assoziierter SMA selten auf, doch für die meisten dominanten Formen ist die genetische Ursache nicht bekannt. Daher konzentriert sich die vorliegende Doktorarbeit auf die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung des krankheitsverursachenden Gens für autosomal dominante spinale Muskelatrophie mit vorwiegender Beinbeteiligung Typ 2 (SMALED2, MIM615290). Durch die Anwendung von Hochdurchsatz-Sequenziertechnologien (NGS) und Sanger Sequenzierung konnten wir die vier folgenden heterozygoten missense-Varianten im Bicaudal D2 (BICD2) Gen (MIM 609797) bei Patienten mit SMALED2 identifizieren: c.320C>T [p.Ser107Leu], c.563A>C [p.Asn188Thr], c.2108C>T [p.Thr703Met] and c.2239C>T [p.Arg747Cys]. Des Weiteren wurden die molekularen Konsequenzen dieser Veränderungen in der Proteinsequenz in vitro und in vivo analysiert, um tiefere Einblicke in die Entstehung der Pathogenität von SMALED2 zu ermöglichen. BICD2 ist ein hoch konserviertes Protein, das mit Proteinen, die im axonalen Transport (Dynein-Dynactin Komplex [DTCN2] und Kinesin [KIF5A]), Endozytose (clathrin heavy chain), vesikulärer Transport (RAB6A) und anderen, interagiert. BICD2 spielt eine wichtige Rolle im retrograden Dynein-abhängigen axonalen Transport entlang der Mikrotubuli, im vesikulären Transport vom Golgi zum endoplasmatischen Reticulum und im Zentrosom. Unsere in vitro Studien zeigten, dass jede der mit SMALED2 assoziierten Mutationen verschiedene zelluläre Konsequenzen nach sich zieht. Diese umfassen Fragmentierung des Golgiapparats, Veränderungen der molekularen Interaktion mit Dynein-Dynactin sowie mit RAB6A (ein Regulator von Transportprozessen zwischen endoplasmatischem Reticulum und Golgiapparat), verminderte Endocytose, Aufspaltung der Zentrosomen sowie Zellzyklusunterbrechung in der G2-Phase, und letztlich die Bildung von Protein Aggregaten. Experimente an Fibroblasten, die von an SMALED2 erkranken Individuen generiert wurden, deuteten auf eine gesteigerte Stabilität der Mikrotubuli hin. Dieses Verhalten war allen getesteten BICD2 Mutationen gemein. Klinische Befunde der betroffenen Individuen lassen vermuten, dass es sich bei SMALED2 um eine primäre Erkrankung der unteren motorischen Neuronen handelt. Murine motorische Neuronen, die mit SMALED2 assoziierten mutierten BICD2 Konstrukten transduziert wurden, zeigten axonale Störungen wie z.B. die häufige Bildung von Verzweigungen und verstärktes axonales Längenwachstum. Letzteres und die erhöhte Stabilität der Mikrotubuli lassen vermuten, dass BICD2 entweder in die Bildung, die Stabilität, oder den Zusammen- und Umbau größerer Mikrotubulifragmente involviert ist. Unsere Daten lassen auf eine neue Funktion von BICD2 bei der Regulation von Mikrotubuli schließen, die – falls beeinträchtigt – einen gemeinsamen Pathomechanismus SMALED2-assoziierter Mutationen darstellt, wobei der Schweregrad der Erkrankung durch individuelle Effekte der jeweiligen Mutation definiert sein könnte. Im Rahmen der durchgeführten in vivo Studien, haben wir das erste Tiermodel für SMALED2 generiert und charakterisiert. Die Taufliege Drosophila melanogaster ist genetisch leicht zu manipulieren und ist ein häufig genutzter Modelorganismus zur Untersuchung neuronaler Erkrankungen. Die Expression mutierter BICD2 Konstrukte in neuronalem Gewebe in Drosophila führte zu deutlichen motorischen Defiziten der jungen, adulten Fliegen und zu verminderter Größe der neuromuskulären Endplatten während der Entwicklung. Verkleinerte motorische Endplatten oder motorische Defizite waren nicht nachweisbar, wenn mutierte BICD2 Konstrukte in muskulärem Gewebe exprimiert wurden. Dies deutet auf ein primär neurogenes Geschehen hin, so wie es an Hand klinischer Daten zu vermuten wäre. Die Identifizierung einiger BICD2 Mutationen in Individuen mit chronischer Myopathie eröffnete eine kontroverse Diskussion über die entweder neuronale oder muskuläre Ätiologie von SMALED2. Histologische und funktionelle Untersuchungen zeigten, dass Myopathie-assoziierte BICD2 Mutationen die Struktur des Golgiapparats verändern und möglicherweise die Exozytose beeinflussen. Außerdem wurde ein klinisch asymptomatischer Träger einer krankheitsverursachenden BICD2 Mutation identifiziert, was auf eine variable Expressivität und ggf. reduzierte Penetranz in Anwesenheit genetisch modifizierender Faktoren hindeutet. Unerwarteter Weise konnten wir eine frühletale Form multipler kongenitaler Arthrogrypose mit respiratorischer Insuffizienz mit de novo Mutationen in BICD2 in Verbindung bringen. Basierend auf diesen Mutationen könnte eine derart schwerwiegende klinische Ausprägung zur Identifizierung weiterer BICD2 bezogener Krankheitsmechanismen führen, die über die von SMALED2 bekannten Mechanismen hinausgehen. Zusammenfassend führten die im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Studien zur Identifizierung von BICD2 als genetische Ursache von SMALED2 und unterstützen durch grundlegende experimentelle Beweisführung die pathologische Kausalität der BICD2 Mutationen. Sie leisten außerdem einen Beitrag zur Identifizierung weiterer BICD2-assoziierter Erkrankungen.

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