Struktur-Funktions-Analyse des pro-apoptotischen Proteins Bax - Kölner UniversitätsPublikationsServer

Heimlich, Gerd (2003). Struktur-Funktions-Analyse des pro-apoptotischen Proteins Bax. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Das pro-apoptotische Protein Bax spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des mitochondrialen Apoptosesignalwegs. Es ist unter anderem maßgeblich an der Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren wie Cytochrom c, AIF und Smac/DIABLO aus dem Intermembranraum der Mitochondrien in das Zytosol beteiligt. Es wurde für die Bax-induzierte Freisetzung von Cytochrom c gezeigt, dass die konformationelle Änderung und Oligomerisierung von Bax, notwendig sind. Der zugrunde liegende Mechanismus der Freisetzung ist jedoch unbekannt. Insbesondere konnten die Domänen von Bax, welche für die Freisetzung von Cytochrom c verantwortlich sind, bislang noch nicht identifiziert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, durch in vitro Studien an isolierten Mitochondrien und rekombinanten Bax Proteinen die für die Freisetzung von Cytochrom c essentiellen Domänen des Proteins zu identifizieren und deren Funktion zu charakterisieren. Der Einfluss der hydrophoben C-terminalen Transmembrandomäne (TM), der BH3-Domäne und der zentralen hydrophoben Helices 5/6 von Bax auf die Freisetzung von Cytochrom c standen dabei im Vordergrund der Untersuchungen. Die Experimentalbefunde zeigten, dass die Transmembrandomäne für die Freisetzung von Cytochrom c durch Bax nicht notwendig ist. Durch eine Kombination verschiedener interner Deletionsmutanten von Bax konnte außerdem gezeigt werden, dass die BH3- Domäne allein für die Freisetzung von Cytochrom c nicht ausreichend ist. Vielmehr ist die Insertion des Bax Proteins in die Mitochondrienmembranen über die Helices 5/6 für die Freisetzung von Cytochrom c essentiell. Durch Analyse des mitochondrialen Membranpotentials und der mitochondrialen Permeabilitätstransition konnte gezeigt werden, dass Bax ohne eine Zerstörung der äußeren Mitochondrienmembran Cytochrom c spezifisch freisetzt. Dafür spricht auch, dass Bax nur ungefähr 20 % des gesamten Cytochrom c Gehalts aus den isolierten Mitochondrien freizusetzen vermag. Schließlich wurde die Fragestellung untersucht, ob die Kompartimentierung von Cytochrom c in den Mitochondrien von Bedeutung ist. Durch Isolation und Rekonstitution von Hexokinase-Porin-ANT-Komplexen konnte gezeigt werden, dass Bax das endogene Cytochrom c aus assoziierten Komplexen in Abhängigkeit von der Substrat- bzw. Produktsättigung der Hexokinase spezifisch freisetzen kann. Diese Beobachtung könnte erklären, warum eine erhöhte Hexokinase-Aktivität die Apoptoserate von Zellen verringern kann. So könnte bei Tumorzellen, bei denen eine verstärkte Glykolyse vorliegt, der mitochondriale Apoptosesignalweg blockiert sein.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

The removal of unwanted cells by apoptosis is of great importance for tissue homeostasis of many organisms. Major key players of the intrinsic apoptotic pathway are the mitochondria. These organells contain a variety of pro-apoptotic factors like cytochrome c, Smac/DIABLO or AIF in their intermembrane space. Once released into the cytosol, these factors participate in the activation of various targets and processes, eventually leading to typical morphological changes, which are characteristic for apoptosis. The release of the pro-apoptotic factors is tightly regulated by the Bcl-2 family proteins. One member of the Bcl-2 family the pro-apoptotic protein Bax, induces the release of cytochrome c and other pro-apoptotic factors. Although a conformational change, oligomerization and insertion into the mitochondrial membranes of Bax have been found to be prerequisites for the induction of cytochrome c release, the essential domains for this process are still elusive. Furthermore, the necessity of a rupture of the outer mitochondrial membrane with regard to the cytochrome c release is hotly debated. In the present thesis, a structure function analysis of the pro-apoptotic Bax protein was performed to characterize important protein domains involved in the in vitro translocation of cytochrome c. Also the question whether outer membrane rupture occurs was addressed. The data obtained show that the transmembrane domain (TM) is not required for the Bax-induced release of cytochrome c. Furthermore, Bax(-TM) was found associated with the mitochondrial membranes indicating that the insertion process is mediated by a distinct Bax domain. The integrity of the BH3 domain of Bax was influenced by deleting a conserved four amino acid motif, comprising IGDE. The corresponding protein induced the release of cytochrome c and it was found associated with mitochondrial membranes. Therefore, it was shown that a functional BH3 domain of Bax is not required for the induction of cytochrome c release from mitochondria. By deleting helices -5 and -6 of Bax it was shown that the insertion of the protein into mitochondrial membranes by this domain is essential for the Bax- mediated translocation of cytochrome c. The rupture of the outer mitochondrial membrane is the result of massive mitochondrial matrix swelling caused by either hyperpolarization, or by opening of the permeability transition pore (PTP). By analyzing the mitochondrial membrane potential and the involvement of the mitochondrial permeability transition, no evidence for a nonspecific outer membrane rupture was found. This indication of a more specific release correlates with the fact, that all functional Bax proteins induced only a maximal release of about 20 % of the total cytochrome c present. Finally, the importance of the distribution of the cytochrome c inside of the mitochondria was addressed. By isolating and reconstituting hexokinase- porin-ANT-complexes it was shown that Bax can induce the release of endogenous cytochrome c specifically organized in this complex. This release occurred only from associated complexes and was dependent on the saturation of hexokinase with its substrates or products. This observation suggests that the mitochondrial apoptotic pathway is blocked in those tumor cells that show an enhanced rate of glycolysis.

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