Universität zu Köln

Silva Ramos, Eduardo (2018). Maintenance and distribution of mammalian mitochondrial nucleoids. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mitochondria derive from the capture of an ancestral α-proteobacteria within an archaeal cell about 2 billion years ago. Since then mitochondria have retained a small proportion of genes within their multi-copy genome mitochondrial DNA (mtDNA) that encode proteins essential to the oxidative phosphorylation system. They have also evolved into a major metabolic hub in eukaryotic cells. Many biosynthetic pathways require mitochondria such as the synthesis of iron-sulfur clusters, heme, lipids and coenzyme Q. However, mitochondria are best known for their efficient ATP production through aerobic metabolism. The mitochondrial network is a dynamic structure. Through coordinated actions of membrane fusion and fission, mitochondria are able to remodel their shapes and sizes, but also their distribution within the cell. Mitochondrial dynamics is an essential process that impacts mammalian physiology in many different ways. One of the clearest examples is the relationship between mitochondrial fusion and mtDNA maintenance. In animal studies, the absence of mitochondrial fusion proteins resulted in severe reduction in mtDNA copy number. Moreover, loss of mitochondrial fusion proteins, mitofusins, was also associated with an increase in mtDNA point mutations and deletions. However, the molecular basis of these findings is poorly understood. The research presented in this thesis aims to address the underlying link between mitochondrial fusion and mtDNA maintenance. We report that inactivation of mitofusin 1 and 2 leads to mtDNA depletion and nucleoid clustering in mouse embryonic fibroblasts and heart tissue. With super-resolution microscopy and fluorescent in situ hybridization, we show that clustered nucleoids have normal diameters and are transcribed. We report that the loss of mtDNA accounts for the reduction in transcription and bioenergetic defects. Moreover, we demonstrate that the profound mtDNA depletion is not explained by genome instability, but instead it is caused by altered stoichiometry of protein components of the mtDNA replisome. Lastly, we show that outer membrane fusion is necessary to sustain rapid mtDNA replication in MEFs recovering from mtDNA depletion and in the mouse heart during postnatal development. We thus report an unexpected link between OMM fusion and replication and distribution of mtDNA in mammalian cells.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Mitochondrien entstanden vor etwa 2 Milliarden Jahren aus der endosymbiotischen Aufnahme eines α-Proteobakteriums in ein Archaeon. Die Evolution führte zu einer starken Reduktion von genetischer Information im mitochondrialen Erbgut. Dieses mitochondriale Multi-Kopien-Genom, die sogenannte mtDNA, kodiert ausschließlich für RNAs und Proteine, welche essentiell für die oxidative Phosphorylierung sind. Ferner haben sich Mitochondrien während der Evolution zu einem wichtigen metabolischen Zentrum in eukaryotischen Zellen entwickelt. So sind Mitochondrien unter anderem an der Biosynthese von Eisen-Schwefel-Clustern, Häm-, Lipid- und Coenzym-Q Molekülen beteiligt. Mitochondrien sind jedoch am bekanntesten für ihre Effizienz bei der ATP-Produktion durch den aeroben Stoffwechsel. In Zellen formen Mitochondrien ein dynamisches Netzwerk, welches durch die koordinierte Fusion und –Spaltung von Membranen die mitochondriale Form, Größe und Verteilung innerhalb der Zelle beeinflusst. Diese mannigfaltigen Prozesse werden unter dem Begriff der mitochondrialen Dynamik zusammengefasst und haben entscheidenden Einfluss die Physiologie der Zelle. Diesbezüglich konnten experimentelle Tierstudien zeigen, dass das Fehlen von mitochondrialen Fusionsproteinen die Gesamtmenge an mtDNA und die Anzahl von mtDNA-Molekülen reduziert. Darüber hinaus berichtet eine Studie, dass der Verlust von Mitofusinen mit einer Steigerung von mtDNA-Punktmutationen und -Deletionen einhergeht. Die molekulare Grundlage dieser Beobachtungen ist jedoch kaum verstanden. Das Ziel dieser Dissertation ist es, die exakten molekularen Mechanismen zwischen mitochondrialer Fusion und mtDNA-Integrität zu untersuchen. Wir zeigen, dass die Inaktivierung von Mitofusin 1 und 2 in embryonalen Mausfibroblasten (MEF) und in konditionalen Maus-Knock-outs zu einer Reduktion und Clusterbildung der mtDNA führt. Mit Hilfe von Super-Resolution-Mikroskopie und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung können wir nachweisen, dass geclusterte Nukleoide interessanterweise eine normale Morphologie haben und transkribiert werden. Ferner können wir durch biochemische Experimente demonstrieren, dass die mtDNA Reduktion die Gesamttranskription verringert und so zu bioenergetischen Defekten beiträgt. Außerdem, zeigen unsere Experimente, dass die starke mtDNA Reduktion nicht durch Genom-Instabilität ausgelöst wird, sondern durch eine gestörte Stöchiometrie der Proteinkomponenten der mtDNA Replikations-maschinerie. Des Weiteren können wir experimentell beweisen, dass die Fusion der äußeren mitochondrialen Membran notwendig ist, um eine schnelle mtDNA-Replikation in MEFs zu gewährleisten. Letzteres erklärt somit auch die wichtige Bedeutung der mitochondrialen Fusion für die postnatale Entwicklung des Mausherzens. Zusammenfassend berichten wir über eine unerwartete Verbindung zwischen der Fusion der äußeren mitochondrialen Membran und der mtDNA Replikation und Verteilung in Säugetierzellen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Silva Ramos, Eduardo esramos@protonmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-91381
Date:	27 August 2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Mitochondrial gene expression English Mitochondrial dynamics English Mitochondrial dysfunction English
Date of oral exam:	15 October 2018
Referee:	Name Academic Title Larsson, Nils-Göran Prof. Dr. Rugarli, Elena Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9138