Universität zu Köln

Upadhyay, Aaradhita (2019). Neurocalcin delta (NCALD) knockout impairs adult neurogenesis whereas half reduction is a safe therapeutic option for spinal muscular atrophy. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Spinal muscular atrophy (SMA) is the second most common recessive monogenic disease characterized by loss of motor neurons and impaired neuromuscular junctions which leads to proximal muscles atrophy. SMA is primarily caused by mutation/loss of survival of motor neuron 1 (SMN1) gene encoding the SMN protein. Interestingly, humans carry additionally SMN2, a copy gene of SMN1 which is relatively new in evolutionary scale of genes and the SMA disease severity is inversely correlated with the copy number of the SMN2 gene. In the recent year, SMA therapeutics achieved a landmark with FDA and EMA approval of the splice modifier molecule named Nusinersen, which is an SMN dependent therapy as it elevates the SMN protein level derived from the SMN2 transcript. However, SMN dependent therapies have not been sufficient to fully cure the SMA, especially in most severe SMA type I patients which may carry even a single allele of SMN2. Therefore, a combinatorial therapy which includes SMN independent strategies would be remarkably beneficial. Certain modifier genes, which upon differential expression can protect against SMA are most relevant and potential candidates to be studied in context of combinatorial therapies. Recently, reduction of a neuronal calcium sensor, Neurocalcin delta (NCALD) significantly ameliorated major SMA symptoms: reduced motor neuron axon length, neuromuscular junction size, muscle fibre size, impaired endocytosis and motor functions in various SMA model systems. Considering these results, reduction of NCALD was proposed for SMA combinatorial therapeutics. However, depending upon the physiological functions of NCALD in various cellular processes, reduction of NCALD may potentially incur certain side effects. NCALD is a member of the brain-enriched neuronal calcium sensor sub-family Visinin like proteins (VILIPs). However, till date only few NCALD functions have been explored based on the functions of its close homologues VILIP1, hippocalcin and guanylate cyclase activating protein (GCAP). Therefore, in this study we first investigated non redundant physiological functions of NCALD by characterizing Ncald knockout (NcaldKO/KO) mice; then referring to the phenotypes of NcaldKO/KO mice we further analysed heterozygous (NcaldKO/WT) mice to verify any potential physiological defects that may arise at 50% NCALD reduction which has been proposed as a potential SMA therapeutic option. Significant changes were observed in the gross brain morphology of adult NcaldKO/KO mice (4 month-old) with bigger ventricles, thinner cortex and smaller hippocampus including significantly reduced length of dentate gyrus sub granular zone. These morphological defects could arise either due to progressive neurodegeneration or impaired brain development/ maturation. Therefore, we investigated major hallmarks of progressive neurodegeneration like loss of mature neurons, astrogliosis, reduced dendritic branching or exacerbation of the gross morphological changes with aging. However, we did not find any evidence of progressive neurodegeneration. On other hand, we found very low NCALD levels in embryonic brain (E16) as well as at birth (P1), however a significant increase was observed at P10, which implies relevance of NCALD during postnatal brain development/ maturation. Therefore, we further investigated generation of doublecortin (DCX) positive new-born granule cells in the dentate gyrus (DG) as well as myelination, two major processes of postnatal brain maturation. We did not observe any changes in DCX positive neurons at P14 and only a tendency of reduction at P30 in NcaldKO/KO brain compared to controls. However, 4-month old adult NcaldKO/KO animals exhibit significantly reduced amount of DCX cells in DG. Loss of DCX positive cells in adult brain is widely accepted as a loss of adult neurogenesis. Furthermore, we investigated the mechanism behind the observed defects in NcaldKO/KO brain by investigating the NCALD interactome using mass spectrometry analysis and as co-immunoprecipitation. We identified a novel NCALD interacting partner named mitogen-activated protein kinase kinase kinase 10 (MAP3K10). MAP3K10 is an upstream kinase in c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway. Therefore we analysed the JNK activation in NcaldKO/KO brain and found significantly upregulated pJNK levels compared to controls. Contrary to these observations, adult NcaldKO/WT brain analysis showed neither JNK activation nor loss DCX positive cells, thereby ruling out the potential side effects of NCALD reduction in adult neurogenesis. Conclusively, this is the first study to report the effect of NCALD deletion on DCX positive neuron generation, which is a widely accepted as adult neurogenesis marker and to identify MAP3K10 as a novel interacting partner of NCALD; additionally it reports on the safety of using NCALD reduction for SMA combinatorial therapy.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Spinale Muskelatrophie (SMA) ist die zweithäufigste rezessive monogene Erkrankung, die durch den Verlust von Motoneuronen und beeinträchtigten neuromuskulären Verbindungen gekennzeichnet ist, was zu einer proximalen Muskelatrophie führt. SMA wird hauptsächlich durch Mutation / Verlust des Überlebens des Motoneuron 1 (SMN1) -Gens, das das SMN-Protein kodiert, verursacht. Interessanterweise tragen Menschen zusätzlich SMN2, ein Kopiegen von SMN1, das im evolutionären Maßstab von Genen relativ neu ist. Der Schweregrad der SMA-Krankheit korreliert negativ mit der Kopienzahl des SMN2-Gens. Im vergangenen Jahr erreichte SMA Therapeutics mit dem Spleißmodifikatormolekül Nusinersen, das eine SMN-abhängige Therapie durch die Erhöhung des SMN-Proteinspiegels aus dem SMN2-Transkript darstellt, die FDA- und EMA-Zulassung. SMN-abhängige Therapien waren jedoch nicht ausreichend, um die SMA vollständig zu heilen, insbesondere bei den meisten schweren SMA-Typ-I-Patienten, die sogar ein einzelnes Allel von SMN2 tragen können. Daher wäre eine kombinatorische Therapie, die SMN-unabhängige Strategien beinhaltet, sehr vorteilhaft. Bestimmte Modifikationsgene, die bei unterschiedlicher Expression gegen SMA schützen können, sind die relevantesten und potentiellsten Kandidaten, die im Zusammenhang mit kombinatorischen Therapien untersucht werden sollen. Kürzlich verbesserte die Reduktion eines neuronalen Calciumsensors, Neurocalcin delta (NCALD), bedeutende SMA-Symptome: reduzierte Axone des motorischen Neurons, neuromuskuläre Übergangsgröße, Muskelfasergröße, gestörte Endozytose und motorische Funktionen in verschiedenen SMA-Modellsystemen. Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse wurde eine Reduktion von NCALD für kombinatorische SMA-Therapeutika vorgeschlagen. In Abhängigkeit von den physiologischen Funktionen von NCALD in verschiedenen zellulären Prozessen kann die Reduktion von NCALD jedoch möglicherweise bestimmte Nebenwirkungen hervorrufen. NCALD ist ein Mitglied der Gehirn-angereicherten neuronalen Kalzium-Sensor-Unterfamilie Visinin like Proteins (VILIPs). Bislang wurden jedoch nur wenige NCALD-Funktionen basierend auf den Funktionen seiner nahen Homologen VILIP1, Hippocalcin und Guanylatcyclase-aktivierendes Protein (GCAP) untersucht. Daher untersuchten wir in dieser Studie zuerst nicht-redundante physiologische Funktionen von NCALD durch Charakterisierung von Ncald-Knockout (NcaldKO/KO) Mäusen; Unter Bezugnahme auf die Phänotypen von Mäusen analysierten wir weiter heterozygote (NcaldKO/WT) Mäuse, um mögliche physiologische Defekte zu bestätigen, die bei 50% NCALD-Reduktion auftreten können, was als mögliche SMA-Therapieoption vorgeschlagen wurde. Signifikante Veränderungen wurden in der Grobhirnmorphologie von adulten NcaldKO/KO Mäusen (4 Monate alt) mit größeren Ventrikeln, dünnerem Kortex und kleinerem Hippocampus, einschließlich einer signifikant reduzierten Länge der subgranularen Zone des dentalen Gyrus, beobachtet. Diese morphologischen Defekte können entweder durch fortschreitende Neurodegeneration oder gestörte Entwicklung / Reifung des Gehirns entstehen. Daher untersuchten wir wichtige Merkmale der progressiven Neurodegeneration wie Verlust von reifen Neuronen, Astrogliose, reduzierte dendritische Verzweigung oder Exazerbation der makroskopischen Veränderungen mit dem Altern. Wir haben jedoch keinen Hinweis auf progressive Neurodegeneration gefunden. Auf der anderen Seite fanden wir sehr niedrige NCALD-Spiegel im embryonalen Gehirn (E16) sowie bei der Geburt (P1), jedoch wurde ein signifikanter Anstieg bei P10 beobachtet, was die Relevanz von NCALD während der postnatalen Gehirnentwicklung / -reifung impliziert. Daher untersuchten wir die Bildung von Doppelkortin (DCX) positiven, neu geborenen Körnerzellen im Gyrus dentatus (DG) sowie die Myelinisierung, zwei Hauptprozesse der postnatalen Gehirnreifung. Wir beobachteten keine Veränderungen in DCX-positiven Neuronen bei P14 und nur eine Reduktionsneigung bei P30 in NcaldKO/KO -Gehirn im Vergleich zu Kontrollen. 4 Monate alte adulte NcaldKO/KO -Tiere zeigen jedoch eine signifikant reduzierte Menge an DCX-Zellen in DG. Der Verlust von DCX-positiven Zellen im adulten Gehirn wird weitgehend als Verlust der adulten Neurogenese angesehen. Darüber hinaus untersuchten wir den Mechanismus hinter den beobachteten Defekten im NcaldKO/KO Gehirn durch Untersuchung des NCALD-Interaktoms mittels Massenspektrometrieanalyse und als Co-Immunopräzipitation. Wir identifizierten einen neuen NCALD-Interaktionspartner namens Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase Kinase 10 (MAP3K10). MAP3K10 ist eine stromaufwärts gelegene Kinase im c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) Signalweg. Daher analysierten wir die JNK Aktivierung in NcaldKO/KO Gehirn und fanden signifikant erhöhte pJNK Werte im Vergleich zu Kontrollen. Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen zeigte adulte NcaldKO/WT -Gehirnanalyse weder eine JNK-Aktivierung noch einen Verlust von DCX-positiven Zellen, wodurch die möglichen Nebenwirkungen der NCALD-Reduktion in der adulten Neurogenese ausgeschlossen wurden. Zusammenfassend ist dies die erste Studie, die den Effekt der NCALD-Deletion auf die DCX-positive Neurogenese, die als adulter Neurogenesemarker weithin akzeptiert ist, und MAP3K10 als einen neuartigen Interaktionspartner von NCALD identifiziert; Darüber hinaus bestätigt die Studie die Sicherheit der Verwendung von NCALD Reduktion für SMA kombinatorische Therapie. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Upadhyay, Aaradhita aaradhita@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-94057
Date:	12 February 2019
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Neurocalcin delta English Adult neurogenesis English Spinal Muscular Atrophy English MAP3 kinase 10 UNSPECIFIED JNK pathway UNSPECIFIED
Date of oral exam:	30 November 2018
Referee:	Name Academic Title Wirth, Brunhilde Prof. Dr. Hammerschimdt, Matthias Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9405