Universität zu Köln

Spoerl, Ziqiang (2003). Functional Analysis of Mammalian Coronin 3. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Functional Analysis of Mammalian Coronin 3 Coronin, an F-actin binding protein, is expressed in a variety of organisms from Dictyostelium to humans. The mammalian coronin family comprises at least seven members, six of which show a similar size and domain structure. Their expression patterns are tissue-specific but overlapping, implying that they possess diverse functions. Little is known about mammalian coronin 3, which was studied in this work. This protein is expressed in different amounts in many mouse tissues, being most abundant in the brain. Due to this, mouse neuroblastoma (Neuro-2a) cells were chosen for the in vivo studies presented here. By immunofluorescence, endogenous coronin 3 was detected both in F-actin-rich structures like growth cones, neurites and intracellular small particles, and in the cytosol. Treatment of cells with colchicine and taxol did not provide any hints that coronin 3 localization depends on microtubules. Proper localization of EGFPHcoronin 3 required both the NH2- and COOH-terminus. Expression of EGFPHcoronin 3 (72-404) that lacked both termini had an inhibitory effect on neurite elongation, which was not the case for the proteins truncated at either terminus. This suggests that coronin 3 is involved in the generation of F-actin-rich cortical extensions. Subcellular fractionation and 2D gel electrophoresis demonstrated that during differentiation of Neuro-2a cells, endogenous coronin 3 translocated from a phosphorylated cytosolic pool to an unphosphorylated membrane- and F-actin associated fraction. A role of PKC in the regulation of other coronins has been reported in the literature. However, addition of the PKC activator PMA and the inhibitor bisindolylmaleimide to differentiated Neuro-2a cells did not significantly change the pI value of coronin 3 in cytosolic and cytoskeletal fractions, nor did it change the localization of the protein. This indicates that the phosphorylation of coronin 3 is independent of protein kinase C. In further experiments, the role of distinct coronin 3 domains for protein function was tested in vitro and in vivo. It turned out that the C-terminal part harbored several features required for molecular interactions. Gel filtration analysis showed that, in contrast to other coronins, coronin 3 is exclusively extracted as an oligomer from both the cytosolic and cytoskeletal fraction. Under native conditions, the cytosolic pool resides in a large complex and the COOH-terminal coiled-coil is essential for the formation of this complex. The COOH-terminal region mediated oligomerization of recombinant fragments in vitro. Furthermore, F-actin cosedimentation assays showed that the COOH-terminal amino acid residues 315-444 without the coiled coil domain are sufficient for F-actin binding and crosslinking in vitro. In contrast to this, the NH2- terminal region had no affinity for F-actin. The fragment coronin 3 (315-474) that contained the coiled coil was capable of recruiting the NH2-terminal coronin 3 (1-71) domain to actin filaments in vitro, implying that intramolecular or intermolecular interactions between the NH2- and COOH-terminal parts might be involved in the association with actin filaments in vivo.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Funktionelle Analyse des Coronin 3 in Säugetieren German
Translated abstract:	Abstract Language Funktionelle Analyse des Coronin 3 in Säugetieren Coronin, ein F-Aktin bindendes Protein, ist in eukaryotischen Organismen von Dictyostelium bis Homo sapiens weitverbreitet. In Säugetieren existiert eine Familie Coronin-ähnlicher Proteine mit 7 bisher bekannten Mitgliedern. Die Coronin- Homologe zeigen gewebsspezifische, jedoch teilweise überlappende Expressionsmuster. Dies deutet darauf hin, dass die Säuger-Coronine divergierende Funktionen entwickelt haben, die über die in Einzellern bekannten hinausgehen. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Coronin 3 untersucht, die noch nahezu unbekannt ist. Coronin 3 ist in vielen Mausgeweben exprimiert, jedoch am stärksten im Gehirn. Es wurden daher Neuro-2a Neuroblastomzellen für die in vivo� Experimente ausgewählt. Immunfluoreszenz zeigte, dass das endogene Coronin 3 einerseits an F-Aktinreichen Strukturen, z.B. �growth cones�, Neuriten und intrazellulären Partikeln, andererseits auch stark zytosolisch lokalisiert ist. Die Behandlung der Zellen mit Colchicin und Taxol ergab keine Hinweise auf eine Mikrotubuli-abhängige Lokalisierung von Coronin 3 wie sie für das Hefehomolog beschrieben wurde. Die Untersuchung von verkürzten EGFP-Hcoronin 3-Fusionsproteinen zeigte, dass sowohl der NH2- als auch der COOH-Terminus notwendig für die korrekte Lokalisation sind. Expression des Proteins EGFP-Hcoronin 3 (72-404), das nur die zentrale WD40-repeat-Domäne enthält, zeigte einen hemmenden Effekt auf die Neuritenelongation, welcher bei Deletion des NH2- oder COOH-Terminus alleine nicht auftrat. Dies deutet darauf hin, dass Coronin 3 bei der Generation von F-Aktinreichen kortikalen Srukturen eine Rolle spielt. Subzelluläre Fraktionierung und 2D Gel-Elektrophorese zeigten, dass endogenes Coronin 3 während der Neuro-2a Differenzierung von einer phosphorylierten zytosolischen Fraktion zu einer dephosphorylierten Membran- und F-Aktinassoziierten Fraktion wandert. Im Gegensatz zu anderen Coroninen, für die in der Literatur PKC-abhängige Phosphorylierung dokumentiert ist, hatten weder der Proteinkinase C-Aktivator PMA noch der spezifische Inhibitor Bisindolylmaleimid einen deutlichen Einfluß auf den pI von Coronin 3 in zytosolischen und partikulären Fraktionen oder auf seine Lokalisation in Neuro-2a-Zellen. Dies weist darauf hin, dass die Phosphorylierung des Proteins von PKC unabhängig ist. Weiterhin wurde die Rolle bestimmter Coronin 3-Domänen in vitro und in vivo untersucht. Es zeigte sich, dass die COOH-terminale Region für unterschiedliche Eigenschaften wichtig ist. Gelfiltrationsergebnisse weisen darauf hin, dass Coronin 3 im Gegenstatz zu anderen Coroninen ausschließlich als Oligomer in der Zelle vorkommt. Unter nativen Bedingungen liegt Coronin 3 im Zytosol als Komplex vor, dessen Bildung von der COOH-terminalen coiled coil Domäne abhängt. Die letzten 30 Aminosäuren waren auch für die Oligomerisierung des rekombinanten COOHTerminus in vitro notwendig. F-Aktin-Kosedimentationsversuche ergaben, dass die COOH-terminalen Aminosäuren 315-444 außerdem für die Bindung an Aktinfilamente hinreichend sind. Dagegen zeigten die NH2-terminalen Aminosäuren 1-71 keine Assoziation mit Mikrofilamenten. Es konnte aber nachgewiesen werden, dass das COOH-terminale Fragment (315-474) den NH2-terminus (1-71) zu Actinfilamenten rekrutieren kann. Dies deutet darauf hin, dass intramolekulare oder intermolekulare Interaktionen zwischen NH2- und COOH-Terminus bei der Assoziation mit Aktinfilamenten eine Rolle spielen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Spoerl, Ziqiang ziqiang.spoerl@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-9474
Date:	2003
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language coronin, WD40 repeat, oligomerization, F-actin binding protein. English
Date of oral exam:	2 July 2003
Referee:	Name Academic Title Noegel, Angelika A. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/947