Universität zu Köln

Stephan, Lisa Marie ORCID: 0000-0002-1296-7548 (2018). Cell morphogenesis in Brassicaceae: Analysis of myosin functions and the BEACH domain protein SPIRRIG. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Precise control of cell growth and expansion is essential for plant performance and adaptation to the environment. During development, cells differentiate into various shapes and sizes, allowing them to carry out specific functions. This specialized morphogenesis is thought to be controlled mostly through endoreduplication and cytoskeletal dynamics. Thus, highly specialised cells like root hairs or trichomes are popular model systems to study these processes. In 1994, a group of distorted trichome mutants was identified in an EMS screen in Arabidopsis thaliana. Apart from altered trichome morphology, all members of this group showed irregular shapes of leaf pavement cells, epidermal hypocotyl cells and epidermal root cells. Most of these distorted mutants were found to be deficient in proteins of the actin regulating ARP2/3 or SCAR/WAVE complex. Strikingly, two of the identified distorted mutants lacked proteins independent of this pathway: myosin XI-K and the BEACH domain protein SPIRRIG. XI-K is a motor protein interacting with the actin cytoskeleton. Aside from its function in transport of organelles, it was found to be essential for actin organisation. In this work, XI-K function was analysed alongside its redundant myosins XI-1, XI-2 and XI-I. In addition, the passive bulk flow and stirring of the cytoplasm were analysed, allowing the distinction of effects caused by active transport of organelles and passive acceleration of the cytoplasm. This study showed that stirring is not sufficient to enhance organelle movement or bulk flow in Arabidopsis leaf cells. In fact, the bulk flow does not differ in wild type and the triple knockout mutant xi-1 xi-2 xi-k, indicating that a deceleration of passive flow of the cytoplasm is not the cause of the distorted phenotype in xi-k mutants. However, myosin XI-K was found to be the sole myosin mediating long range transport of P-bodies and peroxisomes, and that inhibition of XI-K cargos can produce distorted phenotypes. These results indicate that processes associated with these organelles might influence the observed phenotype. Development of the xi-k mutant was found to be unaltered in long term heat and darkness, however, reduced adaptability of xi-k triple and quadruple mutants indicated an involvement in these morphological processes. SPIRRIG, another protein identified to be involved in cell morphogenesis, belongs to the family of BEACH domain containing proteins. Members of this family are known facilitators of membrane dynamics and trafficking. In Arabidopsis, spi mutants were shown to have an intact actin cytoskeleton, indicating that the SPI protein is not involved in actin organisation. In addition, it was found that the Arabidopsis SPI protein is essential for plant salt stress responses, and that it stabilises a variety of transcripts in a salt dependent manner. Here, an evolutionary comparative approach was chosen to elucidate SPI function and importance in planta. Thus, a detailed analysis of SPI in a closely related Brassicaceae, Arabis alpina, was carried out. It was found that the distorted phenotype is similar in Arabis and Arabidopsis, and is likely to be associated with the loss of functional WD40 repeats in the Cterminus of the protein. In contrast to Arabidopsis, it was found that Aaspirrig mutants do not possess fragmented vacuoles in their root hairs, indicating that SPIRRIG is not essential for vacuolar integrity in these cells in Arabis. Moreover, the salt stress response was found to differ in between Aaspi alleles, pointing towards an involvement of the PH/BEACH domain in this process. Finally, new reference genes for qPCR in Arabis alpina were established and utilized to identify differentially regulated transcripts in spirrig mutants under normal and salt stress conditions. Four candidates for future analyses were found which might elucidate the function of SPIRRIG in salt response and reveal associated pathways.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Zellmorphogenese in Brassicaceae: Analyse von Myosin Funktionen und dem BEACH Domänen Protein SPIRRIG German
Translated abstract:	Abstract Language Eine genaue Kontrolle des Zellwachstums und der Zellausdehnung ist für die Leistungsfähigkeit von Pflanzen und ihre Anpassung an die Umwelt von entscheidender Bedeutung. Während der Entwicklung differenzieren sich die Zellen morphologisch, um eine optimale Funktionalität zu gewährleisten. Es wird angenommen, dass diese spezialisierte Morphogenese hauptsächlich durch Endoreduplikation und Zytoskelettdynamik kontrolliert wird. Daher sind hoch spezialisierte Zellen wie Wurzelhaare oder Trichome beliebte Modellsysteme, um diese Prozesse zu untersuchen. Im Jahr 1994 wurde eine Gruppe von distorted Trichom-Mutanten in einer EMS-Mutagenese in Arabidopsis thaliana identifiziert. Abgesehen von der veränderten Trichom-Morphologie weisen alle Mitglieder dieser Gruppe unregelmäßige Formen von epidermalen Zellen des Blattes, des Hypocotyls und der Wurzeln auf. Die meisten der distorted Mutanten besitzen Defekte im Aktin-regulierenden ARP2/3- oder SCAR/WAVE Signalweg. Zwei der identifizierten Mutanten zeigten jedoch Veränderungen in ARP2/3 unabhängigen Proteinen: Myosin XI-K und das BEACH-Domänen Protein SPIRRIG. XI-K ist ein Motor-Protein, das mit dem Aktin-Zytoskelett interagiert. Abgesehen von seiner Funktion beim Transport von Organellen erwies es sich als wesentlich für die Aktinorganisation. In dieser Arbeit wurde die Funktion des XI-K Proteins zusammen mit den redundanten Myosinen XI-1, XI-2 und XI-I analysiert. Zusätzlich wurden der passive Strom und das Stirring (engl. für Rühren) des Zytoplasmas analysiert. Hierdurch wurde die Unterscheidung von Effekten ermöglicht, die durch aktiven Transport von Organellen und passive Beschleunigung des Zytoplasmas verursacht werden. Diese Studie zeigte, dass das Stirring nicht ausreicht, um die Organellbewegung oder den passiven Zytoplasmastrom in Arabidopsis-Blattzellen zu erhöhen. Tatsächlich unterscheidet sich der passive Strom im Wildtyp nicht von der Dreifach-Mutante xi-1 xi-2 xi-k. Dies lässt den Schluss zu, dass eine Verlangsamung des passiven Zytoplasmastroms nicht der Grund für den distorted Phänotyp in xi-k Mutanten ist. Es wurde jedoch gezeigt, dass der Langstreckentransport von P-bodies und Peroxisomen ausschließlich durch Myosin K vermittelt wird, und dass die Blockierung dessen Cargos zu distorted Phänotypen führen kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass Prozesse, die mit diesen Cargos assoziiert sind, den beobachteten Phänotyp beeinflussen könnten. Es wurde festgestellt, dass die Entwicklung der xi-k Mutante in Langzeit-Hitze und -Dunkelheit unverändert blieb. Die verringerte Anpassungsfähigkeit von xi-k Dreifach- und Vierfachmutanten bestätigte jedoch eine Beteiligung des XI-K Proteins an diesen morphologischen Prozessen. SPIRRIG, ein weiteres Protein, das an der Zellmorphogenese beteiligt ist, gehört zur Familie der BEACH-Domänen Proteine. Mitglieder dieser Familie sind bekannte Vermittler von Membrandynamik und -transport. In Arabidopsis wurde gezeigt, dass spi Mutanten ein intaktes Aktin-Zytoskelett aufweisen und somit das SPI Protein nicht an der Aktin- Organisation beteiligt ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das SPI Protein in Arabidopsis essentiell für Reaktionen auf hohe Salinität ist und dass es eine Vielzahl von Transkripten in einer salzabhängigen Weise stabilisiert. In dieser Arbeit wurde ein evolutionär-komparativer Ansatz gewählt, um die Funktion und Bedeutung von SPI in Pflanzen aufzuklären. Daher wurde eine detaillierte Analyse von SPI in einer eng verwandten Brassicaceae, Arabis alpina, durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass der distorted Phänotyp in Arabis und Arabidopsis ähnlich ist und wahrscheinlich mit dem Verlust funktioneller WD40-Domänen im C-Terminus des Proteins einhergeht. Im Gegensatz zu Arabidopsis wurde festgestellt, dass Aaspirrig Mutanten keine fragmentierten Vakuolen in ihren Wurzelhaaren besitzen, was anzeigt, dass SPIRRIG für die Integrität der Vakuolen in diesen Zellen in Arabis nicht essentiell ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Salzstressreaktion der untersuchten Aaspi Allele unterschiedlich ist, was auf eine Beteiligung der PH/BEACH-Domäne in diesem Prozess hinweist. Schließlich wurden neue Referenzgene für qPCR in Arabis alpina etabliert und verwendet, um differentiell regulierte Transkripte in spirrig Mutanten unter Normal- und Salzstressbedingungen zu identifizieren. Vier Kandidaten für zukünftige Analysen wurden gefunden, die die Funktion von SPIRRIG unter Salzstress aufklären und damit verbundene Signalwege aufzeigen könnten. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Stephan, Lisa Marie lisastephan@gmx.net orcid.org/0000-0002-1296-7548 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-94863
Date:	July 2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Brassicaceae, Arabis alpina, SPIRRIG, Myosin German Brassicaceae, Arabis alpina, SPIRRIG, Myosin English
Date of oral exam:	13 September 2018
Referee:	Name Academic Title Hülskamp, Martin Prof.Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9486