Universität zu Köln

Mayakrishnan, Ravikumar (2018). Modulation of transcription and alternative splicing by spliceosome-activating nineteen complex (NTC) in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Components of the spliceosome activating NTC (Nineteen Complex) are conserved in eukaryotes and their mutations in mammals result in early embryonic lethality. In Arabidopsis, the core PRL (PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS) NTC subunit is encoded by two closely related genes PRL1 and PRL2. This provides the unique opportunity to study the regulatory roles of NTC using mutations of the PRL homologs. Whereas inactivation of PRL1 results in dwarfism, early flowering, altered leaf development and hypersensitivity to low temperature, sucrose, ABA and cytokinin, the prl2 mutations cause embryo lethality at the heart stage. Compared to PRL1, the PRL2 mRNA level is about 10-fold lower in both wild type and prl1 mutant seedlings. The viability of prl1 mutant is thus likely maintained by partially overlapping function of PRL2, which secures reduced but still sufficient level of spliceosome activation. Main aim of this work was to characterize the roles of PRL1 and PRL2 in the regulation of transcription and alternative splicing. Deep RNA-Seq analysis identified 5,814 differential expression (DE) and alternative splicing (DAS) events indicating 5-fold higher representation of unspliced introns in upregulated versus downregulated mRNA isoforms in the prl1 mutant compared to wt. About 25% of DAS events identified altered splice sites, and 30% changed mRNA’s ORF removing either N-terminal organellar or secretion signal peptides, or increasing C-terminal distance between polyA and translational stop codons to enhance mRNA degradation by nonsense-mediated decay (NMD). 25% of DE mRNAs carried alternative 5’ or 3’ ends indicating that the prl1 mutation also influences the positions of transcription start and polyadenylation/cleavage. Functional reannotation and GO analysis of dataset indicated upregulation of genes involved in cell division, UV response, DNA repair, iron uptake, anthocyanin biosynthesis, and ABA/oxidative stress responses, in contrast to downregulation of genes in cell elongation, vesicular transport, auxin signaling and redox-regulated pathogen defense and cell death pathways correlating with known phenotypic traits of the prl1 mutant. In a subset of DE genes, we characterized the effect of prl1 mutation on alternative splicing of ribosomal protein genes. To obtain prl2 mutant cell populations, we used a conditional genetic complementation system for generation of genetic mosaics, in which the prl2 mutant sectors were labelled by expression of the green fluorescent protein (GFP). Following enrichment of mosaic sectors in callus and cell suspension cultures, the GFP+ prl2 and GFP- wild type cell populations were separated by cell sorting and subjected to a similar deep RNA-Seq analysis. This study identified 6314 DE/DAS events, which were compared to those observed in prl1. This lead to the identification of numerous candidate genes implicated in meiotic recombination, fertilization, embryogenesis, DNA replication and post-embryonic development which are differentially downregulated in the prl2 mutant. These data suggest that NTC complexes carrying PRL1 and PRL2 control transcription and splicing of mRNAs coding for both overlapping and distinct cellular functions.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Komponenten des Spliceosome-aktivierenden NTC (Nineteen Complex) sind in Eukaryoten konserviert und ihre Mutationen in Säugertieren führen zu einer frühen embryonalen Letalität. In Arabidopsis wird die PRL (PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS) -NTC-Untereinheit durch zwei eng verwandte Gene PRL1 und PRL2 kodiert. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, die regulatorisch Bedeutung von NTC unter Verwendung von Mutationen der PRL-Homologen zu untersuchen. Während die Inaktivierung von PRL1 zu Zwergwuchs, frühem Blühen, veränderter Blattentwicklung und Überempfindlichkeit gegen niedrige Temperaturen, Saccharose, ABA und Cytokinin führt, verursachen die prl2-Mutationen eine Embryoletalität im Herzstadium während der Embryogenese. Im Vergleich zu PRL1 ist die PRL2-mRNA-Menge sowohl in Wildtyp- als auch in pr11-Mutantensämlingen etwa 10-fach niedriger. Die Lebensfähigkeit der pr11-Mutante wird daher wahrscheinlich durch teilweise überlappende Funktionen von PRL2 aufrechterhalten, was eine reduzierte, aber immer noch ausreichende Spleißosomaktivierung sicherstellt. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Rolle von PRL1 und PRL2 in der Regulation von Transkription und alternativem Spleißen zu charakterisieren. Eine RNA-Seq Analyse identifizierte 5.814 differentiel expremierte (DE) und alternative gesplicte (DAS) Transkripte, die eine 5-fach höhere Repräsentation von ungespleißten Introns in hochregulierten gegenüber herunterregulierten mRNA Isoformen in der prl1 Mutante im Vergleich zu wt zeigten. Etwa 25% der DAS-Ereignisse zeigten veränderte Spleißstellen und 30% änderten den mRNA-ORF, wobei entweder N-terminale Organell- oder Sekretionssignalpeptide entfernt wurden oder der C-terminale Abstand zwischen PolyA und Translationsstopcodons erhöht wurde, was den mRNA-Abbau durch Nonsense-vermittelten Abbau verstärkt. 25% der DE-mRNAs trugen alternative 5'- oder 3'-Enden, was darauf hinweist, dass die pr11-Mutation auch die Positionen von Transkriptionsstart und Polyadenylierung/Spaltung beeinflusst. Die funktionelle Re-Annotation und die GO-Analyse des Datensatzes zeigten eine Hochregulation von Genen, die an Zellteilung, UV-Reaktion, DNA-Reparatur, Eisenaufnahme, Anthocyanbiosynthese und ABA / oxidativen Stressreaktionen beteiligt sind, im Gegensatz zur Herabregulierung von Genen bei Zellverlängerung, vesikulärem Transport und Auxinsignalisierung und Redox-regulierter Pathogenabwehr und Zelltod, die mit bekannten phänotypischen Merkmalen der prl1-Mutante korrelieren. In einem Teil der DE-Genen charakterisierten wir den Effekt der pr11-Mutation auf das alternative Spleißen von ribosomalen Protein Transcripten. Um Zellpopulationen von prl2-Mutanten zu erhalten, verwendeten wir ein konditionales genetisches Komplementationssystem zur Erzeugung von genetischen Mosaiken, in dem die prl2-Mutantensektoren durch Expression des grün fluoreszierenden GFP Proteins markiert wurden. Nach der Anreicherung der Mosaiksektoren in Kallus- und Zellsuspensionskulturen wurden die Zellpopulationen von GFP+ prl2 und GFP- Wildtyp durch Zellsortierung getrennt und mit RNA-Seq untersucht. Diese Studie identifizierte 6314 DE / DAS-Ereignisse, die mit denen in prl1 verglichen wurden. Dies führte zur Identifizierung zahlreicher Kandidatengene, die an meiotischer Rekombination, Fertilisation, Embryogenese, DNA-Replikation und postembryonalen Entwicklung beteiligt sind, und die in der prl2-Mutante differentiell herunterreguliert sind. Diese Daten legen nahe, dass NTC-Komplexe, die PRL1 und PRL2 tragen, die Transkription und das Spleißen von mRNAs steuern, die für überlappende sowie für unterschiedliche zelluläre Funktionen kodieren. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Mayakrishnan, Ravikumar ravikumar@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-95199
Date:	23 August 2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language alternative splicing UNSPECIFIED spliceosome activating complex (NTC) UNSPECIFIED PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS 1 (PRL1) UNSPECIFIED PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS 2 (PRL2) UNSPECIFIED
Date of oral exam:	16 October 2018
Referee:	Name Academic Title Coupland, George Prof. Dr. Hülskamp, Martin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9519