Isolation und Charakterisierung von Plasmazellen aus dem peripheren Blut mit besonderer Berücksichtigung IgE sezernierender Plasmazellen

Horst, Alexander (2002). Isolation und Charakterisierung von Plasmazellen aus dem peripheren Blut mit besonderer Berücksichtigung IgE sezernierender Plasmazellen. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Plasmazellen (PC) spielen eine wichtige Rolle in den verschiedensten Immunantworten. Ihre geringe Häufigkeit vor allem im Blut führte dazu, dass sie in vielen Fragen nur unzureichend erforscht sind. Da es lange Zeit auch keine Oberflächenmoleküle gab, die eine direkte Anreicherung von PC aus dem peripheren menschlichen Blut ermöglicht hätten, erschwerte dies die Charakterisierung der PC zusätzlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur Isolation und Detektion von PC aus dem peripheren Blut entwickelt. CD138 ist ein Molekül, dass zu Beginn der PC Entwicklung hochreguliert wird und auf zirkulierenden B-Zellen oder anderen Zellen im peripheren Blut nicht vorkommt. An CD138 gebundene Mikropartikel wurden benutzt, um CD138+ PC aus dem Blut schnell und direkt magnetisch anreichern zu können. Die so erreichten Reinheiten von über 80% ermöglichten eine detaillierte Analyse der PC. Die Analyse legt nahe, dass es sich bei den CD138+ Zellen um frühe PC handelt, die kürzlich gebildet wurden und auf dem Weg in ihr Zielgewebe sind. Da nur etwa die Hälfte aller PC im Blut CD138 exprimieren, wurde im weiteren Verlauf eine Methode zur Detektion aller Ig sezernierenden Zellen entwickelt. Bei dieser Methode, der zellulären Affinitätsmatrix Technologie, wird eine künstliche Fangmatrix auf die Zellen gebracht, die in der Lage ist, von der Zelle sezerniertes Ig einzufangen, wo es anschließend mit einem beliebigen Detektionsantikörper nachgewiesen werden kann. Somit ließen sich alle IgA, IgE und mit Einschränkungen auch IgG sezernierenden PC im Blut nachweisen. Es konnte gezeigt werden, dass etwa 50-80% aller IgE oder IgG, aber nur 25-50% aller IgA sezernierenden PC CD138 exprimieren. Diese beiden Methoden zur PC Anreicherung bzw. PC Detektion wurden angewandt, um IgE+ PC im Blut von Normalspendern, Atopikern und einem HIE Patienten nachzuweisen. Durch die CD138 Anreicherung und die anschließende intrazelluläre IgE Färbung ergab sich ein extrem sensitives Detektionssystem, das in der Lage war, in 80% aller Normalspender IgE+CD138+ PC nachzuweisen, was es von Arbeiten anderer Arbeitsgruppen deutlich abhebt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Zahl IgE+CD138+ PC in Atopikern und dem HIE Patienten teilweise um das 100-1000-fache erhöht sind und dass die Häufigkeit der IgE+CD138+ PC mit dem gemessenen IgE Serumtiter hoch signifikant korreliert. Die Analyse Antigen-spezifischer CD138+ PC im Verlauf einer spezifischen Immuntherapie mit Bienen- oder Wespengift war ein weiterer Teil dieser Arbeit. Die Zahl PLA+CD138+ PC, sowie deren Ig Subklassen Verteilung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Therapie bestimmt. Dabei zeigte sich, dass bis zu 23% PLA-spezifische CD138+ PC kurzzeitig im Blut auftauchen. Diese Zellen verschwinden nach einigen Tagen wieder komplett aus dem Blut, lassen sich aber zu späteren Zeitpunkten kurz nach einer weiteren Insektengiftinjektion erneut nachweisen. Allerdings nimmt die Zahl der PLA-spezifischen PC im Verlauf der Therapie stark ab und ihr Isotyp ändert sich von IgE hin zu IgG was Indizien für einen Erfolg der Therapie sind.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Plasma cells play an important role in many immune responses. Their low frequency especially in blood hampered their detailed analysis and therefore many questions still remain. The fact that for a long time no surface markers were available to directly enrich PC from human peripheral blood further aggravated the phenotypic analysis of the PC. During this work two methods for the isolation and detection of PC from peripheral blood were developed. CD138 is a molecule, which is upregulated early during PC development. It is not expressed on circulating B-cells or other cells in peripheral blood. We used CD138 conjugated microbeads to magnetically enrich CD138+ PC from peripheral blood. The accomplished purities of more than 80% allowed a detailed phenotypic analysis of the PC. The enriched CD138+ cells exhibit the phenotype of early plasma cells, which have been recently generated and being on the way to their final destination. As only half of the PC in blood express CD138 we further developed the cellular affinity-matrix technology, a method for the detection of all Ig secreting cells. We labelled cells with an artificial matrix being able to catch Ig secreted by the cells. The caught Ig can then be detected using an adequate detection antibody. Consequently we were able to detect all IgA, IgE and with some restrictions also IgG secreting cells in blood. It could be shown that approximately 50-80% of all IgE and IgG but only 25-50% of all IgA secreting cells do express CD138. These two methods for the enrichment and detection of PC were used to identify IgE+ PC in the blood of normal donors, atopic patients and one HIE patient. Combining CD138 enrichment with the intracellular staining for IgE resulted in an extremely sensitive detection system being able to identify IgE+CD138+ PC in 80% of normal donors standing out this method against the work done by other groups. Additionally it could be shown that the number of IgE+CD138+ PC in atopics and the HIE patient was 100-1000 fold higher than in normal donors and that the frequency of IgE+CD138+ PC and the IgE serum titres correlated highly significantly. The analysis of antigen-specific CD138+ PC during specific immunotherapy with bee- or wasp-venom was another part of this work. The number of PLA+CD138+ PC as well as their Ig subclasses was determined at different time points during therapy. It could be shown that up to 23% of PLA-specific CD138+ PC can be temporary found in blood. These cells disappear after some days completely from blood but reappear at later time points shortly after the last injection of the allergen. However the number of PLA-specific PC decreases strongly during therapy and their isotype switches from IgE to IgG indicating a success of the immunotherapy.

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