Funktionelle Charakterisierung des AtPIN1-Proteins aus Arabidopsis thaliana

Tietz, Olaf (2003). Funktionelle Charakterisierung des AtPIN1-Proteins aus Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die AtPIN1-cDNA wurde unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors in A. thaliana exprimiert. In transgenen Pflanzen wurde in Western-Blot Analysen eine erhöhte AtPIN1- Menge in Wurzeln nachgewiesen. Immuncytochemisch wurde ectopisch exprimiertes AtPIN1 in Wurzelspitzen und Sproßachsen, genauso wie endogenes AtPIN1 polar, an basalen Zellenden nachgewiesen. Keimlinge von stark AtPIN1-überexprimiernde Linien zeigten gravitrop gestörtes Wurzelwachstum und eine erhöhte Anzahl von Seitenwurzeln. Weiterhin wurde bei diesen Linien in Wurzelspitzen qualitativ eine verstärkte- und ectopische Aktivität des Auxin-sensitiven DR5-Promotorelements festgestellt. In Sproßachsen von AtPIN1- überexprimierenden Pflanzen wurde eine konzentrationsabhängig verringerte Sensitivität des polaren Auxintransports gegenüber dem spezifischen Inhibitor NPA gemessen. Weiterhin wurde AtPIN1 unter der Kontrolle eines Glucocorticoid-induzierierbaren Promotors in A. thaliana exprimiert in Western-Blot-Analysen auf Blättern wurde eine induzierbare AtPIN1- Expression nachgewiesen. Mit Glucorticoid behandelte Pflanzen zeigten hyponastisches Blattwachstum. Von diesen Pflanzen wurde eine Suspensionskultur angelegt und mittels Tritium-markiertem Auxin in Kompetitionsanalysen mit überschüßigem Auxin der saturierbare Auxinefflux gemessen, wobei die AtPIN1-überexprimierende Suspensionkultur einen erhöhten Efflux aufwies. Die Inhibierbarkeit durch NPA war durch AtPIN1- Überexpression in konzentrationsabhängiger Weise verringert. In Wurzelspitzen von A. thaliana, welche die Serin/Threonin-Kinase PINOID überexprimieren, wurde immuncytochemisch die Lokalisierung von AtPIN1, 2 und 4 untersucht. In polarisierten Zellen waren im Wildtyp apikal lokalisierte AtPIN-Proteine in diesen Pflanzen am basalen Zellende lokalisiert. In Sproßachsen wurde eine revertierte AtPIN1-Lokalisierung festgestellt, wobei der polare Auxntransport nicht verändert war.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

AtPIN1-cDNA was expressed under control of CaMV35S promotor in A. thaliana. An increased amount of AtPIN1 in roots of transgenic plants was detected by western-blot analysis. Ectopically expressed AtPIN1 was detected in immunolocalisation experiments in root tips and inflorescence axes, similar to endogenous AtPIN1, at the lower side of cells. Highly AtPIN1 overexpressing seedlings showed agravitropic root growth and an increased number of lateral roots. Furthermore an enhanced and ectopic activity of the auxin-inducible promotor DR5 was observed in root tips of these seedlings. The polar auxin transport in inflorescence axes of AtPIN1 overexpressing plants showed a concentration dependent decreased sensitivity against the specific inhibitor NPA. Further on AtPIN1 was expressed under control of a Glucocorticoid inducible promotor. Inducible AtPIN1-expression in leaves was detected by western-blot analysis. Glucocorticoid treated plants showed hyponastic leaves. A suspension culture was prepared from these plants. Auxin-Efflux was measured in competition analysis with tritium labelled Auxin, whereby AtPIN1-overexpressing suspension culture had a larger saturable Auxin-Efflux. The sensitivity of Auxin-Efflux in AtPIN1 overexpressing suspension culture against NPA was reduced in a concentration dependent manner. In immunolocalisation studies in root tips of serine/threonine-kinase PINOID overexpressing A. thaliana the localisation of AtPIN1,2 and 4 was analysed. In wildtype plants at apical end of cell localised AtPIN-proteines showed in these plants a basal localisation. In inflorescence axes there was also a reverted localisation of AtPIN1 observed, whereby the polar auxin transport was not altered.

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