Universität zu Köln

Neumaier, Felix ORCID: 0000-0002-6376-6391 (2020). Modulation of Cav2.3 voltage-gated calcium channels by trace metal ions and trace metal chelators. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

BACKGROUND: The trace metal ions Zn2+ and Cu2+ are increasingly recognized as endogenous modulators of neuronal transmission, hormone secretion and synaptic plasticity. Cav2.3-type voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs) are among their most sensitive targets and have an expression pattern that coincides with the spatial distribution of histochemically reactive trace metals in the brain, suggesting that they could represent a main mediator for their reported neuro-modulatory effects. Although non-conserved histidine residues on the external side of domain I have been convincingly implicated in the effects of trace metals on Cav2.3 channel gating, the exact mechanisms involved and their (patho)physiological relevance remain incompletely understood. AIMS: Aim of the articles compiled in the present thesis was to shed some light on the exact mechanisms of Zn2+- and Cu2+-induced Cav2.3 channel modulation and their potential relevance under normal and pathophysiological conditions. METHODS: In publication 1, crystallographic data of a Ca2+-selective bacterial model channel was used as a framework to theoretically analyze eukaryotic VGCC structure, function and modulation by inorganic cations. In publication 2, general protocols for preparation and use of metal ion-buffered solutions were developed and a fluorescent Zn2+ sensor was used to illustrate the importance of proper metal ion-buffering. In publication 3, conventional and perforated patch-clamp recordings together with different inhibitors and cytosolic factors were used to study Cav2.3 channel run-down during electrophysiological recordings, which was critical to optimize the conditions for experiments performed in publication 6. In publication 4, the effects of intraperitoneal injection of the Zn2+ chelator DEDTC on blood glucose homeostasis, glucose tolerance and peptide hormone secretion in Cav2.3-deficient and -competent mice were analyzed, insulin secretion was examined in isolated islets of Langerhans from both genotypes and the Zn2+-dependence of DEDTC effects on cloned Cav2.3 channels was verified using whole-cell patch-clamp recordings. In publication 5, whole-cell patch-clamp and electroretinographic recordings were used to characterize a receptor-independent but Cu2+-dependent mechanism of Cav2.3 channel modulation by the glutamate-receptor agonist kainic acid (KA). In publication 6, whole-cell patch-clamp recordings were used to characterize Zn2+-induced changes in Cav2.3 channel function and to develop a Markov model for Cav2.3 channel gating under control conditions and in the presence of physiological Zn2+ concentrations. RESULTS: Publication 1 provided novel insights into eukaryotic VGCC function and modulation by trace metal ions. Publication 2 demonstrated the critical importance of proper metal ion buffering to avoid deviations between nominal and actual free metal ion concentrations. Publication 3 showed that run-down of Cav2.3 channel currents is associated with changes in channel gating and that it can be prevented or delayed by hydrolysable ATP through a mechanism that critically depends on protein phosphorylation by serine/threonine kinases. Publication 4 revealed severe glucose intolerance in Zn2+-depleted Cav2.3-deficient but not vehicle-treated Cav2.3-deficient or Zn2+-depleted wildtype mice. In addition, fasting glucose and glucagon levels were significantly higher in Cav2.3-deficient mice, whereas Zn2+ chelation significantly increased blood glucose and glucagon concentrations in wildtype but not Cav2.3-deficient mice. Application of DEDTC significantly stimulated cloned human Cav2.3 channels when applied in the presence of Zn2+ but had no effect in the presence of the Zn2+ chelator CaEDTA. Publication 5 uncovered that KA can stimulate cloned human Cav2.3 channels in the absence of functional KA receptors by reversing Cu2+-induced suppression in vitro, presumably via formation of stable kainate-Cu2+ complexes. When the chelator tricine was used as a surrogate to study the receptor-independent effects of KA in the isolated bovine retina, it selectively reduced a late ERG b-wave component that was previously shown to be enhanced by pharmacologic or genetic ablation of Cav2.3 channels. Publication 6 demonstrated that Zn2+-induced changes in Cav2.3 channel function are complex and inconsistent with a single mechanisms of action. Computer simulations were used to show that most, but not all of the effects can be reconciled by a simplified Markov model that involves Zn2+ binding to a first site with an associated electrostatic modification and mechanical slowing of one of the voltage-sensors and Zn2+-binding to a second, lower affinity site which blocks the channel and modifies the opening and closing transitions. DISCUSSION: With regard to Zn2+-induced Cav2.3 channel modulation, the results in publication 6 point to an intricate dependence on the prevailing neuronal properties and ionic conditions, which could profoundly influence and even invert the net Zn2+ action. Thus, due to Zn2+-induced parallel changes in activation and inactivation voltage-dependence, the net action is strongly affected by the holding potential, can be either inhibitory or stimulatory and may persist for several minutes after cessation of the Zn2+ signal. This could conceivably play a role for certain forms of synaptic sensitization or plasticity, and might also be relevant for e.g. the regulation of Cav2.3 channels in pancreatic islets, where sudden cessation of Zn2+ supply from β-cells is thought to serve as one of the switch-off signals for α-cell glucagon secretion. In support of the latter notion, the findings in publication 4 provide evidence for an involvement of Cav2.3 channels in the Zn2+-mediated suppression of glucagon secretion during hyperglycemia and indicate that Cav2.3 channel dysfunction could lead to severe disturbances in glucose homeostasis, especially under conditions of Zn2+-deficiency. Based on the results of publications 5 and 6, a decrease or reversal of Zn2+ and Cu2+-induced Cav2.3 channel suppression by endogenous (i.e. glutamate) or exogenous (i.e. KA) trace metal chelators, moderate acidification or depolarization of the neuronal resting membrane potential could also contribute to the pro-convulsive role of Cav2.3 channels demonstrated in previous investigations, although the pathophysiological relevance of these finding in vivo remains to be firmly established. Finally, the findings in publication 3 suggest that protein phosphorylation is required for normal Cav2.3 channel function and that it could modify the normal properties of currents carried by these channels. Conclusion: The articles compiled in this thesis provide several novel insights into the mechanisms underlying reciprocal Cav2.3 channel modulation by trace metal ions and trace metal chelators as well as first evidence for their importance under (patho)physiological conditions. Moreover, while still far from complete, the model developed in publication 6 provides a quantitative framework for understanding Zn2+ effects on Cav2.3 channel function and a first step towards the application of computational approaches for predicting the complex action of Zn2+ on neuronal excitability.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language HINTERGRUND: Die Spurenmetallkationen Zn2+ und Cu2+ werden zunehmend als endogene Botenstoffe erkannt, welche in die Regulierung von neuronaler Erregbarkeit, Hormonfreisetzung und synaptischer Plastizität involviert sind. Cav2.3 spannungsgesteuerte Ca2+ Kanäle gehören zu deren sensibelsten Targets und weisen ein Expressionsmuster auf, das mit der Verteilung von histochemisch reaktiven Spurenmetallkationen im Gehirn übereinstimmt, so dass sie einen Hauptmediator für deren neuro-modulatorischen Effekte darstellen könnten. Obwohl nicht-konservierte Histidinreste auf der extrazellulären Seite von Domäne I nachweislich eine Rolle für Spurenmetall-induzierte Veränderungen im Schaltverhalten von Cav2.3 Kanälen spielen, sind viele Fragen bezüglich der zugrundeliegenden Mechanismen und ihrer (patho)physiologischen Relevanz bisher unbeantwortet. ZIELE: Ziel der in dieser Arbeit zusammengestellten Artikel war es, einen besseren Einblick in die exakten Mechanismen der Zn2+- und Cu2+-vermittelten Modulation von Cav2.3 Kanälen sowie deren potentieller Bedeutung unter normalen und pathophysiologischen Bedingungen zu erhalten. METHODEN: In Publikation 1 wurden auf Basis kristallographischer Daten eines Ca2+-selektiven bakteriellen Modellkanals die Struktur, Funktion und Modulation von eukaryotischen Ca2+ Kanälen theoretisch analysiert. In Publikation 2 wurden generelle Protokolle für die Herstellung und Verwendung von Spurenmetallionen-gepufferten physiologischen Lösungen erarbeitet und deren praktische Bedeutung mit einem fluoreszenten Zn2+ Indikator untersucht. In Publikation 3 wurden konventionelle und perforierte Ganzzell Patch-clamp Messungen sowie verschiedene Inhibitoren und zytosolische Faktoren verwendet um den Run-down von Cav2.3 Kanälen während elektrophysiologischer Messungen zu untersuchen und die Messbedingungen für die Versuche in Publikation 6 zu optimieren. In Publikation 4 wurde untersucht, wie intraperitoneale Injektionen des Komplexbildners DEDTC die Blutglukose-Homöostase, Glukosetoleranz und Peptidhormonfreisetzung in Cav2.3-defizienten und -kompetenten Mäusen beeinflussen. Außerdem wurde die Insulinfreisetzung in isolierten Langerhans Inseln beider Genotypen verglichen sowie die Zn2+-Abhängigkeit der Effekte von DEDTC auf rekombinante Cav2.3 Kanäle in Ganzzell Patch-Clamp Messungen verifiziert. In Publikation 5 wurden Ganzzell Patch-clamp Messungen und elektroretinographische Ableitungen zur Charakterisierung eines Rezeptor-unabhängigen, Cu2+-abhängigen Mechanismus der Cav2.3 Kanal Modulation durch den Glutamatrezeptor Agonisten Kainsäure (KA) untersucht. In Publikation 6 wurden die elektrophysiologischen Effekte von Zn2+ auf rekombinante Cav2.3 Kanäle untersucht und ein Markov Model für deren Schaltverhalten unter Kontrollbedingungen sowie in Gegenwart physiologisch relevanter Zn2+ Konzentrationen entwickelt. ERGEBNISSE: Publikation 1 erbrachte neue Erkenntnisse zur Funktion eukaryotischer spannungsgesteuerter Ca2+ Kanäle und deren Modulation durch Spurenmetallkationen. Publikation 2 veranschaulichte die Wichtigkeit von Metallionen-Puffern zur Vermeidung von Abweichungen zwischen der nominellen und tatsächlichen freien Metallionenkonzentration in physiologischen Lösungen. Publikation 3 ergab, dass der Run-down von Cav2.3 Kanälen mit Veränderungen im Schaltverhalten verbunden ist, dass er durch hydrolisierbares ATP verhindert oder verlangsamt werden kann und dass Serin/Threonin Kinasen kritisch für die protektiven ATP Effekte sind. Publikation 4 ergab, dass Blutglukose und Serum Glukagon Spiegel in Cav2.3-defizienten Mäusen im Vergleich zu Cav2.3-kompetenten Mäusen signifikant erhöht sind, während Zn2+ Depletion mit DEPC zu einem signifikanten Anstieg von Blutglukose und Serum Glukagon Spiegeln in Cav2.3-kompetenten aber nicht in Cav2.3-defizienten Mäusen führt. DEPC Behandlung führte außerdem zu einer schweren Glukoseintoleranz in Cav2.3-defizienten Mäusen, während die Glukosetoleranz in unbehandelten Cav2.3-defizienten sowie behandelten und unbehandelten Cav2.3-kompetenten Mäusen unbeeinträchtigt war. In in vitro Versuchen stimulierte DEPC den Ca2+ Einfluss durch rekombinante Cav2.3 Kanäle in der Gegenwart von Zn2+ aber nicht in der Gegenwart des Zn2+ Komplexbildners CaEDTA. Publikation 5 ergab, dass KA rekombinante Cav2.3 Kanäle durch eine Umkehr Cu2+-induzierter Inhibition, die vermutlich auf Bildung stabiler Kainat-Cu2+ Komplexe beruht, auch in Abwesenheit funktioneller Glutamat Rezeptoren stimulieren könnte. Simulation der Rezeptor-unabhängigen Effekte von KA durch Applikation des Komplexbildners Tricin in der isolierten Rinderretina führte zur selektiven Abnahme in der Amplitude einer späten Komponente der elektroretinographischen b-Welle, für welche in früheren Arbeiten eine Stimulation durch genetische oder pharmakologische Ablation von Cav2.3 Kanälen gezeigt wurde. Publikation 6 ergab, dass die Zn2+-induzierten Veränderungen im Schaltverhalten von Cav2.3 Kanälen komplex sind und mehr als einen einzelnen Wirkmechanismus umfassen. Mittels Computersimulationen wurde gezeigt, dass die meisten, aber nicht alle, Effekte durch ein vereinfachtes Modell reproduziert werden können, bei dem Zn2+ Interaktion mit einer ersten Bindungstelle zu einer elektrostatischen Modifikation und mechanischen Verlangsamung eines der Spannungssensoren führt und Zn2+ Interaktion mit einer zweiten Bindungstelle von niedrigerer Affinität den Kanal blockiert und zu einer Verlangsamung des Öffnungs- und Schließverhaltens führt. DISKUSSION: Bezüglich der Zn2+-induzierten Modulation von Cav2.3 Kanälen deuten die Ergebnisse aus Publikation 6 auf komplexe Wechselwirkungen mit den vorherrschenden neuronalen und ionischen Bedingungen hin, welche die Zn2+ Wirkung beeinflussen und sogar umkehren könnten. So hängt der Gesamt Zn2+ Effekt auf Cav2.3 Kanäle aufgrund paralleler Veränderungen in der Spannungsabhängigkeit von Aktivierung und Inaktivierung stark vom Haltepotential ab, kann sowohl inhibierend als auch stimulierend sein und für mehrere Minuten nach Beendigung des Zn2+ Signals andauern. Neben einer möglichen Rolle für bestimmte Mechanismen der synaptischen Sensibilisierung und Plastizität könnten diese Effekte für die Regulation von Cav2.3 Kanälen in den Langerhans Inseln des Pankreas relevant sein, wo eine plötzliche Einstellung der Zn2+ Freisetzung aus β-Zellen als eines der Switch-off Signale für die Glukagon Freisetzung aus α-Zellen zu dienen scheint. Letztere Annahme wird durch die Ergebnisse in Publikation 4 untermauert, welche erste Belege für eine Rolle von Cav2.3 Kanälen für die Zn2+-vermittelte Inhibition der Glukagonfreisetzung unter hyperglykämischen Bedingungen liefern und zeigen, dass Cav2.3 Kanaldysfunktion, besonders in Kombination mit Zn2+-Defizienz, zu schweren Störungen der Glukosehomöostase führen könnte. Basierend auf den Ergebnissen der Publikationen 5 und 6 könnte eine Abnahme bzw. Umkehr der Zn2+ und Cu2+ vermittelten Inhibition von Cav2.3 Kanälen durch endogene (z.B. Glutamat) oder exogene (z.B. KA) Komplexbildner, mäßige Acidose oder Depolarisation des neuronalen Ruhemembranpotentials möglicherweise auch zur pro-konvulsiven Rolle dieser Kanäle beitragen, welche in früheren Arbeiten belegt wurde. Schließlich legen die Ergebnisse aus Publikation 3 nahe, dass Proteinphosphorylierung kritisch für die normale Funktion von Cav2.3 Kanälen ist und ihre elektrophysiologischen Eigenschaften modifizieren könnte. KONKLUSION: Die in dieser Arbeit zusammengestellten Artikel liefern verschiedene neue Erkentnisse über die Mechanismen der reziproken Modulation von Cav2.3 Kanälen durch Spurenmetallkationen und Komplexbildner sowie erste Erkenntnisse zu ihrer möglichen Bedeutung unter (patho)physiologischen Bedingungen. Obwohl das in Publikation 6 erarbeitete Model als vorläufig anzusehen ist, bietet es eine quantitative Grundlage zum Verständnis der Effekte von Zn2+ auf Cav2.3 Kanäle und einen ersten Schritt in Richtung der Anwendung computerbasierter Methoden zur Prognose der komplexen Wirkung von Zn2+ auf die neuronale Erregbarkeit. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Neumaier, Felix felix@neumaier-net.de orcid.org/0000-0002-6376-6391 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-115622
Date:	2020
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Physiologie und Pathophysiologie > Institut für Neurophysiologie
Subjects:	Chemistry and allied sciences Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language voltage-gated calcium channels; endogenous trace metal ions; trace metal chelators; electrophysiology; patch-clamp measurements; English
Date of oral exam:	27 April 2020
Referee:	Name Academic Title Eichinger, Ludwig Prof. Dr. Kloppenburg, Peter Prof. Dr. Herzig, Stefan Prof. Dr.
Funders:	Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Köln Fortune (KF)
Projects:	DFG: SCHN 387/21-1, DFG: SCHN 387/21-2, KF: 259/2013
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/11562