Universität zu Köln

Neef, Andreas (2004). Molekulare Grundlagen der Modulation von HCN-Kanälen durch Protonen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Hyperpolarisationsaktivierte und zyklisch Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle (HCN-Kanäle) spielen eine wichtige Rolle bei der Erzeugung rhythmisch aktiver Prozesse im Herzen und in vielen Nervenzellen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass diese Kanäle auch in einer Gruppe von Geschmackszellen vorkommen und dort an der depolarisierenden Antwort auf saure Stimuli beteiligt sind. Unter Sauerstimulation (< pH 6) aktivieren HCN-Kanäle schneller und bei weniger negativen Spannungen. Die molekularen Grundlagen dieser pH-Abhängigkeit sind noch unbekannt. Es war das Ziel dieser Arbeit, diese Fragestellung zu untersuchen. Durch zielgerichtete Mutagenese wurden neun verschiedene negativ geladene Aminosäuren im HCN1-Kanal neutralisiert. Die Eigenschaften der Mutanten wurden in einem heterologen Expressionssystem elektrophysiologisch untersucht. Die Aktivierungseigenschaften wurden anhand der Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit sowie anhand der Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik charakterisiert. Nicht alle dieser Mutanten bildeten funktionelle Kanäle. Die Untersuchung ergab, dass die funktionellen Mutanten im Vergleich zum Wildtypkanal ähnlich stark durch Protonen beeinflusst werden. Für zwei der nichtfunktionellen Mutanten konnte die Kanalfunktion "gerettet" werden, indem ein weiterer Aminosäureaustausch im S4-Segment vorgenommen wurde. Es handelt sich dabei um die Aminosäuren D172 (in S2) und D222 (in S3), die jeweils zusammen mit dem Arginin R259 (in S4) neutralisiert wurden. Die Doppelmutanten waren funktionell, ihre Aktivierungseigenschaften unterschieden sich jedoch massiv von denen des Wildtypkanals. Tatsächlich waren diese Mutanten über den gesamten untersuchten Spannungsbereich fast vollständig geöffnet, ein Zustand, der dem des vollständig protonierten Wildtypkanals entsprechen könnte. Diesen können wir leider experimentell nicht erfassen, da die Zellen pH-Werte unterhalb von 4 nicht tolerieren. Die Ergebnisse machen es aber wahrscheinlich, dass D172 und D222 Teile des gesuchten Protonensensors darstellen. In einem zweiten Ansatz, die pH-Abhängigkeit der HCN-Kanäle zu untersuchen, wurde das Asparagin N168 in S2 durch eine zusätzliche negativ geladene Aminosäure ersetzt, einmal durch Asparaginsäure (N168D) und einmal durch Glutaminsäure (N168E). In diesen Mutanten sind Spannungsabhängigkeit und auch pH-Abhängigkeit einiger Parameter deutlich verschieden von denen des Wildtypkanals. Schätzt man pKs-Werte aus den verschiedenen pH-Abhängigkeiten ab, so erhält man größere Werte als beim Wildtyp. Ich interpretiere diese Ergebnisse so, dass die neu eingeführte negative Ladung die dielektrischen Eigenschaften in der Umgebung des Protonensensors so verändert, dass sich dessen pKs-Wert verschiebt. Der gesuchte Protonensensor sollte also in der Nähe der Position 168 liegen. Das ist für D172 der Fall, wahrscheinlich auch für D222. Ich schließe aus den Ergebnissen, dass D172 und D222 mit großer Wahrscheinlichkeit den gesuchten Protonensensor des HCN1-Kanals bilden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language The molecular basis of HCN-channel modulation by protons English
Translated abstract:	Abstract Language Hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated ion channels (HCN) mediate an inward cation current that contributes to spontaneous rhythmic activity in the heart and the brain. In a subset of taste cells HCN channels contribute to the depolarizing response evoked by sour stimuli. The gating properties of HCN channels are dramatically altered if extracellular pH drops below 6. Channel activation at low pH is much faster and occurs at less negative potentials than at neutral pH. The underlying molecular mechanism of the pH sensitivity has not been determined. The aim of this work was to identify the proton sensor(s) of the rHCN1 channel and to elucidate the mechanism that couples proton binding to the alteration of gating properties. Site-directed mutagenesis was employed to neutralize nine different negatively charged amino acids that could serve as pH-sensor. Mutants were heterologously expressed in HEK293 cells and characterized with electrophysiological methods. Gating properties were quantified by the voltage dependence of open probability (Po-V-relation) and time constants of activation and deactivation. For none of the functional mutants the pH dependence of these parameters was abolished. Five of the nine targeted residues could not be changed without a loss of function. For D172N in S2 and D222N in S3 this loss was reversed by a second amino acid exchange in S4 (R259Q). The double mutants were functional. However, their PO-V-relation and activation kinetics were significantly different from wildtype properties in a way that resembles the effect of complete protonation of the wildtype channel. Unfortunately it is not possible to protonate the pH-sensor in wildtype channels completely within the pH-range that is tolerated by the HEK293 cells (pH > 4.0). Although a direct comparison between a completely protonated wildtype and the double mutants is therefore not possible, these results indicate that D172 and D222 are part of the proton sensor in HCN1 channels. In a further attempt to alter the pH dependence of the channel, N168 in S2 was replaced by an aspartate or a glutamate. Again the pH dependence of the Po-V-relation and the pH dependence of activation and deactivation time constants was quantified and apparent pKs values were estimated. For some of the parameters the apparent pKS values estimated for the mutant HCN1-N168D were significantly larger than those estimated for the wildtype. I conclude that the introduced negative charge influenced the apparent pKs value of a nearby proton sensor. This effect might be caused by local accumulation of protons around the negative group of the aspartate's side chain. Based on that interpretation a proton sensor should be close to N168 in the wildtype channel. The aspartate D172 is located very close to position 168 and so is probably also D222. Based on the results of two different approaches, residues D172 and D222 are probably proton sensors of HCN-wildtype channels. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Neef, Andreas a.neef@fz-juelich.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12915
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Ionenkanal , Schrittmacher , Ih , Aktivierung , pH German ion channel , pacemaker , protons , activation , pH English
Date of oral exam:	27 May 2004
Referee:	Name Academic Title Kaupp, U. Benjamin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1291