Universität zu Köln

Müller, Tim (2005). Regulation of glutamate dehydrogenase in Corynebacterium glutamicum and its impact on nitrogen control. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Global regulatory networks are essential for the adaptation to changing environmental conditions and allow bacteria to survive conditions of stress and starvation. Nitrogen control is one of these networks. It regulates the uptake and assimilation of nitrogen containing compounds in dependence on their availability. In Corynebacterium glutamicum, a gram-positive soil bacterium of important biotechnological relevance, glutamate dehydrogenase (GDH) seems to play an important but so far less investigated role in nitrogen control. In this work, the regulation of glutamate dehydrogenase and its impact on nitrogen control in C. glutamicum were investigated. Transcription of gdh is induced under nitrogen limitation. By DNA affinity purification with magnetic beads, four transcriptional regulators were isolated, which bind specifically to a fragment of the gdh promoter region that is responsible for the nitrogen-dependent transcription control. These are the putative transcriptional regulators FarR, WhiH, and OxyR, and the well-characterized transcriptional regulator AmtR, which is a major player of nitrogen control C. glutamicum. The exact binding sites of AmtR and FarR were mapped and a principle capacity of FarR to repress gdh-promoter-driven transcription was demonstrated. Surprisingly, neither single deletions nor a quadruple deletion of amtR, farR, whiH, and oxyR in C. glutamicum have any effect on nitrogen-dependent transcription of gdh. Consequently, these regulators are not essential for the nitrogen-dependent regulation of gdh transcription. Nevertheless, they might regulate gdh transcription in response to other stress conditions. A broad range of stress conditions were identified that influence gdh transcription. In addition, a putative role of FarR in the regulation of fatty acid biosynthesis and/or glutamate overproduction was revealed. In the second part of this work, the role of GDH in nitrogen control of C. glutamicum was investigated. A deletion of gdh results in a deregulation of the nitrogen control network. It was demonstrated, that this effect is caused by the loss of GDH activity and not by the absence of the GDH protein itself. In the gdh deletion strain, internal 2-oxoglutarate is accumulated. A high 2-oxoglutarate pool seems to antagonize the nitrogen status and triggers a nitrogen starvation-like response even under nitrogen surplus. In addition, ammonium could be identified as a second metabolite that influences nitrogen control in C. glutamicum. In the third part of this work, it was demonstrated that ammonium is not toxic for C. glutamicum and the formation of a putative futile cycle of ammonium was not observed.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Die Regulation der Glutamatdehydrogenase in Corynebacterium glutamicum und ihr Einfluss auf die Stickstoffkontrolle German
Translated abstract:	Abstract Language Globale Regulationsnetzwerke sind essentiell für die Adaptation an unterschiedliche Umweltbedingungen und ermöglichen Bakterien das Überstehen von Stress- und Mangelsituation. Die Stickstoffkontrolle ist ein solches Netzwerk. Sie reguliert die Aufnahme und Verstoffwechselung stickstoffhaltiger Substrate in Abhängigkeit von deren Verfügbarkeit. Bei der Stickstoffkontrolle des Gram-positiven Bodenbakteriums Corynebacterium glutamicum, welches eine große biotechnologische Bedeutung hat, scheint die Glutamatdehydrogenase (GDH) eine wichtige, bislang unbekannte Funktion einzunehmen. In dieser Arbeit wurde die Regulation der GDH und ihr Einfluss auf die Stickstoffkontrolle von C. glutamicum untersucht. Die Transkription des gdh-Gens wird unter Stickstoffmangel induziert. Mit Hilfe magnetischer DNA-Affinitätsaufreinigung wurden vier Transkriptionsregulatoren isoliert, welche spezifisch an den Abschnitt der gdh-Promotorregion binden, der für die stickstoffabhängige Regulation verantwortlich ist. Dies sind die drei putativen Transkriptionsregulatoren FarR, WhiH, OxyR sowie der bereits charakterisierte Transkriptionsregulator AmtR, welcher ein zentraler Regulator der Stickstoffkontrolle von C. glutamicum ist. Die genauen Bindestellen von AmtR bzw. FarR innerhalb der gdh-Promotorregion wurden identifiziert und die prinzipielle Fähigkeit zur Repression gdh-Promotor-abhängiger Transkription für FarR gezeigt. Trotz allem führen weder Einfachdeletionen noch die Mehrfachdeletion aller Gene der vier Regulatoren zu einem Verlust der stickstoffabhängigen Transkriptionsregulation von gdh. Folglich regulieren AmtR, FarR, WhiH und OxyR die Transkription von gdh nicht in Abhängigkeit von der Stickstoffversorgung, könnten aber unter anderen Bedingungen aktiv sein. In dieser Arbeit wurden zahlreiche Stressbedingungen identifiziert, welche die Transkription von gdh beeinflussen. Außerdem wurde eine weitere Bindestelle von FarR vor dem dtsR2-Gen identifiziert, was auf eine mögliche Rolle von FarR bei der Regulation der Fettsäurebiosynthese und/oder Glutamatüberproduktion schließen lässt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Bedeutung der GDH für die Stickstoffkontrolle von C. glutamicum untersucht. Eine Deletion des gdh-Gens führt zu einer Deregulierung der Stickstoffkontrolle von C. glutamicum. Dieser Effekt beruht auf einem Verlust der GDH-Aktivität und nicht auf der Abwesenheit des GDH-Proteins an sich. Der Verlust der GDH-Aktivität führt zu einer Akkumulation von -Ketoglutarat, was selbst unter guter Stickstoffversorgung eine Stickstoffmangelreaktion auszulösen scheint. Des Weiteren wurde gezeigt, dass auch die Verfügbarkeit von Ammonium die Stickstoffkontolle von C. glutamicum direkt beeinflusst. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Ammonium für C. glutamicum nicht toxisch ist. Die Anwesenheit eines putativen energieverschwendenden Transmembranzyklus von Ammonium konnte nicht beobachtet werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Müller, Tim tim.mueller@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16307
Date:	2005
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium , glutamicum , Glutamatdehydrogenase , gdh , Regulation German Corynebacterium , glutamicum , glutamate , dehydrogenase , gdh English
Date of oral exam:	27 November 2005
Referee:	Name Academic Title Burkovski, Andreas Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1630