Universität zu Köln

Chakkalakal Anandan, Salin (2005). Genotype-phenotype relations in patient-derived point mutations in collagen II. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Collagen II is the major collagen present in the extracellular matrix of cartilage, in addition it is found in the vitreous of the eye and it is also detected during early embryogenesis. Due to the complexity of the biosynthesis, assembly and secretion, collagen II is highly susceptible to mutations leading to disease states which are broadly classified as chondrodysplasias. Most of these mutations are substitutions of glycine in the Gly-X-Y repeats in the triple helical domain resulting in destabilization of the helix. Point mutations leading to arginine to cysteine substitution are interesting since they occur at either X or Y position and cause two different diseases termed Stickler syndrome and congenital spondyloepiphyseal dysplasia (SEDC) in association with osteoarthritis. The present study aimed at determining the consequences of arginine to cysteine substitutions in either X or the Y position in the Gly-X-Y repeats and at either the N- or the C- terminus of the triple helix. The impact of these mutations on protein trafficking, secretion and cell survival was also analyzed. Biochemical studies revealed great similarities between R75C, R134C and R704C collagens and the wild type molecules with the exception that electron micrographs of R75C collagen displayed kinks in the structure. R740C and R789C collagens accumulated in the cells and the R789C protein migrated faster on SDS gels. The R740C and R789C proteins were also susceptible to protease digestion and circular dichroism spectra were altered and showed lower Tm values than other collagen II variants. Due to the altered structure, R789C protein was more susceptible to MMP cleavage in the vicinity of the mutation causing the truncation of the protein. Additionally, electron micrographs revealed only scarce and thin filamentous structures in preparations of R740C and R789C protein. The biochemical results indicate that the R740C and R789C proteins have unstable triple helices and that this affects the overall protein structure. Protein trafficking was monitored in HT1080 cells expressing the collagen II variants. Intracellular retention in the ER due to misfolding of the R740C and R789C proteins triggered an ER stress response including splicing of XBP-1 and induction and binding of BiP. Continuous accumulation of misfolded proteins in the ER caused apoptosis of the R740C and R789C expressing cells. Substitution of arginine to cysteine in the X or Y position towards the C-terminus of the triple helix caused pronounced instability of the triple helix with a deleterious effect on the cells, while R704C and more N-terminal mutations did not cause any significant changes irrespective of being in the X or the Y position. The different severities of patient phenotypes are due to a combination of structural factors, which may be synergistically augmented by genetic modifiers, additional unknown mutations and environmental factors.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Collagen II ist der Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix des Knorpels. Außerdem wird Collagen II im Glaskörper des Auges exprimiert und konnte während der frühen embryonalen Entwicklung nachgewiesen werden. Collagen II ist durch seine komplexe Biosynthese, Assemblierung und Sekretion besonders anfällig für Mutationen, die im Menschen zu Krankheiten führen, die allgemein unter dem Begriff Chondrodysplasien zusammengefasst werden. Bei den meisten dieser Mutationen handelt es sich um den Austausch eines Glycins in den Gly-X-Y Triplets der tripelhelikalen Domäne, die zu einer Destabilisierung dieser Helix führen. Punktmutationen, die zu einem Austausch von Arginin zu Cystein führen, kommen sowohl in der X- als auch Y-Position vor und führen interessanterweise zu zwei unterschiedlichen Krankheitsbildern, dem Stickler Syndrom bzw. der congenitalen Spondyloepiphysiären Dysplasie verbunden mit Osteoarthrose. In der vorliegenden Arbeit wurden Auswirkungen von Substitutionen eines Arginins zu einem Cystein sowohl in der X- als auch in der Y-Position bzw. im N- oder C-terminalen Bereich der Tripelhelix untersucht. Außerdem wurden Effekte dieser Mutationen auf den intrazellulären Proteintransport, die Sekretion und die Zellvitalität analysiert. Biochemische Untersuchungen ergaben keinerlei wesentliche Unterschiede zwischen den Mutanten R75C, R134C und R704C im Vergleich mit dem Wildtyp Protein mit Ausnahme der elektronenmikroskopischen Aufnahmen, in denen die Mutation R75C zu charakteristischen Knicken in der Struktur des Collagens führte. Die Proteine R740C und R789C akkumulierten intrazellulär, und das Collagen R789C zeigte veränderte Laufeigenschaften im SDS Gel. Die Proteine R740C und R789C waren außerdem empfindlicher gegenüber Proteasen, und die Analyse mittels CD Spektroskopie ergab untypische Spektren und erniedrigte Schmelztemperaturen. Die durch die veränderte Struktur erhöhte Empfindlichkeit des Proteins R789C gegenüber dem Abbau durch MMPs in unmittelbarer Nähe der Mutation führte zu einer Verkürzung des Proteins durch Proteolyse. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen der Proteine R740C und R789C konnten nur kurze filamentöse Strukturen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass die Proteine R740C und R789C lediglich instabile Tripelhelices ausbilden und die Mutationen so die Gesamtstruktur des Proteins beeinflussen. Der intrazelluläre Transport der mutierten Proteine wurde in transfizierten HT1080 Zellen untersucht. Die fehlgefalteten Proteine R740C und R789C wurden im endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten und lösten eine ER Stressantwort aus, die mit einem Splicing von XBP-1 und einer erhöhten Induktion und Bindung des Chaperons BiP einhergeht. Die andauernde Akkumulation dieser fehlgefalteten Proteine im ER führte schließlich zur Auslösung der Apopotse. Der Austausch von Arginin zu Cystein im C-terminalen Bereich der Tripelhelix führte sowohl in der X- als auch der Y-Position zur Instabilität der Tripelhelix mit schädlichen Auswirkungen auf die exprimierenden Zellen. Im Gegensatz hierzu resultierten bereits die Mutation R704C und weiter N-terminal gelegene Mutationen in keinerlei signifikanten Veränderungen, unabhängig davon, ob sie in der X- bzw. Y-Position vorlagen. Die in Patienten beschriebenen, sehr unterschiedlich ausgeprägten Krankheitsbilder sind wahrscheinlich durch eine Kombination sich synergistisch verstärkender struktureller und genetischer Faktoren sowie unbekannter Mutationen und Umwelteinflüsse zu erklären. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Chakkalakal Anandan, Salin akd96@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16743
Date:	2005
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut II für Biochemie
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language collagen II, Chondrodysplasia, ER stress English
Date of oral exam:	1 December 2005
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1674