Kopecky, Caroline (2008). Rekombinante Immunrezeptoren als Biosensoren und signalabhängige Produzenten heterologer Produkte. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die noch immer hohe Mortalitätsrate maligner Erkrankungen beruht zu 90% auf einer Metastasierung des Primärtumors durch disseminierte Tumorzellen. Die spezifische Detektion der zirkulierenden Tumorzellen im Serummilieu ist für die Diagnose, eine präzisere Krankheitsprognose oder zur postoperativen Verlaufskontrolle von besonderem Interesse. Derzeitige Verfahren sind technisch aufwändig und wenig sensitiv, so dass die Forderung nach neuen Nachweisverfahren besteht. Als Zielstruktur können tumorassoziierte Antigene dienen, die jedoch in hoher Konzentration auch in das Serum abgegeben werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zellulärer Biosensor entwickelt, der spezifisch membrangebundenes carcinoembryonales Antigen (CEA), das in den meisten kolorektalen Karzinomen hoch exprimiert wird, auch in Gegenwart dessen löslicher Form detektiert. Signalgeber des Sensors ist ein rekombinanter Immunrezeptor, der für die adoptive Immuntherapie entwickelt wurde. Sein modularer Aufbau umfasst einen extrazellulären Teil aus einem antigenbindenden rekombinanten Antikörperfragment (scFv) mit einer CH2-CH3 Gelenkregion des humanen IgG1, sowie der intrazellulären CD3zeta Signalkette des T-Zellrezeptors. Der Signalgeber wird in einer gentechnisch modifizierten Jurkat T-Zelle exprimiert, die mit einem NFAT-Luciferase Reporter ausgestattet ist und nach antigenspezifischer Kreuzvernetzung des Rezeptors auf der Zelloberfläche ein optisches Signal generiert. Der Biosensor mit Spezifität für CEA wurde durch antigenbeladene Sepharosebeads bei gleichzeitiger Toleranz des löslichen CEA in hoher Dosis spezifisch aktiviert. Dies demonstriert die Fähigkeit des Biosensors zur spezifischen Detektion von membrangebundenem CEA auch in Gegenwart hoher Serumkonzentrationen, wie sie in Tumorpatienten bei fortgeschrittenem Krankheitsverlauf zu finden ist. Durch den Einsatz des fluoreszierenden Ca2+-sensitiven Cameleon-Proteins als Reporter ist ein Sensorsignal in nahezu Echtzeit möglich. Zudem wurde gezeigt, dass der Biosensor durch eine kombinierte CD28-CD3zeta Rezeptorsignalkette die Detektion von löslichem Antigen ermöglicht. Der hier vorgestellte zelluläre Biosensor bietet ein attraktives und flexibles System zur schnellen, hoch spezifischen und sensitiven Detektion hämatogen zirkulierender Tumorzellen, das zwischen dem korpuskulären und dem löslichen Antigen diskriminiert. Weiterhin wurde das Biosensorkonzept in einem immuntherapeutischen Ansatz in T-Lymphozyten angewendet, um die Sekretion des immunstimulierenden Zytokins IL-12 nach Bindung von CEA+ Tumorzellen zu induzieren. T-Zellen, die mit dem NFAT-induzierten Gen für IL-12 und einem CEA-spezifischen Immunrezeptor ausgestattet wurden, zeigten nach antigenspezifischer Bindung IL-12 Sekretion. Diese führte zu einer Steigerung der IFN-gamma Sekretion und Lyse von CEA+ Tumorzellen durch modifizierte T-Zellen gegenüber T-Zellen mit Expression des Immunrezeptors allein. Das System zur signalabhängigen Produktion eines kostimulatorischen Zytokins verspricht, ein immuntherapeutisches Adjuvans spezifisch am Tumorort zu konzentieren, infolgedessen die Gefahr der systemischen Toxizität minimiert wird.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:
AbstractLanguage
The majority of cancer deaths is due to the dissemination of tumor cells and subsequent formation of metastatic lesions. The detection of circulating tumor cells is therefore expected to be a powerful tool in the evaluation of cancer prognosis. Current strategies for detecting and isolating disseminated tumor cells are technically limited and still suffer from very low sensitivity and specificity, which is in part due to high serum concentrations of tumor-associated antigens (TAAs). Here, we developed a cellular biosensor that selectively targets membranebound carcinoembryonic antigen (CEA) of colorectal cancer in the presence of the soluble CEA. The signaling device of the sensor is a recombinant immunoreceptor, which is modularily composed of an extracellular single chain antibody fragment (scFv) for binding and an intracellular CD3zeta signaling domain. The receptor is expressed in genetically modified Jurkat T-cells, equipped with an intracellular NFAT-luciferase indicator, which enables the biosensor to generate a light signal after antigen-specific crosslinking of the immunoreceptor on the cell surface. The biosensor with specificity for CEA was activated upon binding of CEA coated on sepharose beads while ignoring high levels of soluble antigen. This demonstrates the feasibility of the biosensor for specific detection of membrane-bound CEA in the presence of high serum concentrations of CEA as found in cancer patients during progression of the disease. By using the fluorescent Ca2+-sensitive Cameleon protein as reporter, the biosensor acts in nearly real time. While these biosensors detect corpuscular CEA, soluble CEA is detected by a combined costimulatory CD28-CD3zeta signalling domain. Taken together the biosensor provides a versatile system to detect circulating tumor cells in a fast, highly specific and sensitive fashion by clearly discriminating corpuscular versus soluble antigen. We moreover adopted the biosensor concept to an immunotherapeutic approach to induce the production of the immune stimulatory cytokine IL-12 in human T-lymphocytes upon specific binding to CEA+ tumor cells. NFAT-triggered IL-12 and the CEA-specific immunoreceptor were coexpressed in T-cells which secrete IL-12 upon receptor binding to CEA. Moreover, the secretion of IFN-gamma and cytolysis of CEA+ tumor cells is increased compared to T cells with anti-CEA receptors only. Recombinant immunoreceptor triggered secretion of a heterologous protein thereby provides a stategy for the concentration of an immunotherapeutic adjuvans specifically at the tumor site, while preventing systemic toxicity.English
Creators:
CreatorsEmailORCID
Kopecky, Carolinecaro.kopecky@gmx.deUNSPECIFIED
URN: urn:nbn:de:hbz:38-24564
Subjects: Life sciences
Uncontrolled Keywords:
KeywordsLanguage
Immunrezeptor, T-Zelle, CEA, Biosensor, IL-12German
immunoreceptor, t-cell, CEA, biosensor, IL-12English
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Institute for Genetics
Language: German
Date: 2008
Date of oral exam: 24 June 2008
Referee:
NameAcademic Title
Brüning, JensProf. Dr.
Refereed: Yes
URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2456

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