Universität zu Köln

Quasdorff, Maria (2008). Die Bedeutung von zellulären Wirtsfaktoren für die Hepatitis B Virus Replikation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Bedeutung von zellulären Wirtsfaktoren für die Hepatitis B Virus Replikation Eine Vertikale Übertragung des Hepatitis B Virus (HBV) ist trotz der verfügbaren Vakzination eine häufige Ursache für chronische Hepatitis, Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom weltweit. Im Allgemeinen wird von einer Virusübertragung während oder nach der Geburt ausgegangen. Allerdings wurde vor kurzem gezeigt, dass HBV die intakte trophoblastische Barriere im ersten Trimester der Schwangerschaft durchdringen und infektiös bleiben kann. Bisher ist unbekannt, ab welchem Stadium der Leberentwicklung HBV die Hepatozyten oder hepatozytäre Vorläufer-Zellen infizieren kann und ab wann die Expression der HBV Gene und HBV Replikation beginnen. In diesem Zusammenhang bleibt es unklar, inwiefern die Effizienz der HBV Replikation von hepatozytärer Differenzierung abhängt und welche hepatozellulären Faktoren dafür verantwortlich sind. Das Ziel dieser Studie war somit die Bestimmung des Startpunktes der HBV Replikation und die Analyse der Dynamik der HBV Replikation bei hepatozytärer Reifung während der fötalen und postnatalen Leberentwicklung. Zusätzlich wurde beabsichtigt die hepatozellulären Faktoren zu finden, welche die HBV Replikation und hepatozytäre Differenzierung miteinander verbinden. Marker der HBV Replikation: HBV DNA, prägenomische RNA (pgRNA), Core und L-Proteine wurden in HBV-transgenen Mausmodellen (HBV 1.3, HBV 1.3 xfs) mittels molekularbiologischen, biochemischen und immunhistologischen Untersuchungen ab dem embryonalen Tag (ET) 12.5 während der embryonalen, fötalen und postnatalen Leberentwicklung (bis zu der vierten postanatalen Woche) untersucht. Zusätzlich wurden die Effizienz der HBV Replikation und Expressionslevels der hepatozyten-spezifischen Transkriptionsfaktoren in den Zellen hepatozytärer Abstammung mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad (primäre humane Hepatozyten (PHH), Hepatoma Zellinien (HepG2, Huh7, differenzierte und undifferenzierte HepaRG cells) und niedrig differenzierte Pop10 Zellen) miteinander verglichen. Obwohl alle Hepatozyten der HBV-transgenen Mäuse das Virusgenom besitzen und pgRNA - die Matrize für die Reverse Transkription � ab dem ET 12.5 exprimierten, fand die Neusynthese viraler DNA erst postnatal in der ersten postnatalen Woche statt. HBV Core Protein konnte erst am ET 18.5 und L-Protein nicht vor Geburt detektiert werden. Alle Marker der HBV Replikation stiegen während der Leberentwicklung kontinuierlich an und erreichten die Levels der adulten Tiere zwischen der zweiten und der vierten postnatalen Wochen. In vitro, war die Effizienz der HBV Replikation am höchsten in PHH und stieg während der Differenzierung der HepaRG Zellen an. Die Expression der pgRNA korrelierte eng mit der Effizienz der HBV Replikation und dem Grad hepatozytärer Differenzierung. Die Levels von HNF4alpha, HNF1alpha und HNF3gamma waren am höchsten in PHH, die HBV am besten replizieren, und am geringsten in Pop10 Zellen, in denen keine Expression der pgRNA und HBV Replikation detektiert werden konnten. Die Expressionslevels von HNF4alpha, HNF1alpha and HNF3gamma nahmen während der Differenzierung der HepaRG Zellen zu. Knock-down von HNF4alpha und HNF1alpha, aber nicht von HNF3gamma, führte zur signifikanten Inhibition der Expression der HBV Gene, der HBV Replikation, Akkumulierung der cccDNA und Sekretion der HBV Nachkommenviren. Außerdem korrelierten die Expressionslevels von HNF4alpha, HNF1alpha und PGC-1alpha eng mit Markern der HBV Replikation während der Leberentwicklung. Obwohl die Transkription der HBV Prägenome schon in den frühen Stadien der Leberentwicklung in HBV-transgenen Mäusen detektierbar ist, fängt die HBV Repl;ikation erst postnatal an. Die Effizienz der HBV Replikation nahm parallel mit der Leberreifung zu, was darauf hindeutet, dass die Differenzierung der Hepatozyten den Startpunkt der HBV Replikation bestimmt. In vivo, in HBV-transgenen Mäusen sowie in vitro, in Zellen hepatozytärer Abstammung, hängt die HBV Replikation stark von der hepatozytären Differenzierung ab. Hierbei stellt die Transkription der pgRNA den limitierenden Schritt dar. Hohe Expressionslevels von HNF4alpha und HNF1alpha sind für eine effiziente HBV Replikation erforderlich. Die Levels von HNF4alpha in Zusammenhang mit denen von HNF1alpha und PGC1alpha stellen eine Verbindung zwischen der HBV Replikation und hepatozytärer Differenzierung her und sind für einen späten Beginn und Dynamik der HBV Replikation während der Leberentwicklung verantwortlich. Die Ergebnisse dieser Studie erbringen neue Einblicke in die Interaktionen zwischen dem Virus und dem Wirt, was für die Etablierung neuer HBV-Modelle, Entwicklung neuer Therapieansätze und Prophylaxe gegen intrauterine HBV Infektion hilfreich sein kann.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language The importance of host cellular factors for Hepatitis B Virus replication English
Translated abstract:	Abstract Language The importance of host cellular factors for hepatitis B virus replication Vertical transmission of Hepatitis B Virus (HBV) is a frequent cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma worldwide despite available vaccination and is generally assumed to occur during or after birth. However, recently HBV has been shown to be able to cross the intact trophoblastic barrier in early pregnancy and to remain infectious. So far, it is unknown, at what stage of liver development HBV can infect hepatocytes or hepatocyte precursor cells, and when HBV gene expression and replication start. In this context, it has not been thoroughly investigated, to what extent the efficiency of HBV replication depends on hepatocyte differentiation and which hepatocellular factors are responsible for that. Therefore, the purpose of this study was to define the starting point and analyze changes in HBV replication along with hepatocyte maturation during fetal and postnatal liver development. Additionally, I aimed to find out hepatocellular factors linking HBV replication to hepatocyte differentiation. Markers of HBV replication: HBV DNA, pregenomic RNA (pgRNA), core and L-proteins were analyzed in HBV-transgenic mouse models (HBV 1.3, HBV 1.3 xfs) by molecular biological, biochemical and immunohistological methods starting from embryonic day (ED) 12.5 through early liver development until 4 weeks postnatally. In addition, efficiency of HBV replication and expression levels of hepatocyte-enriched transcription factors were compared in cells of hepatocyte origin with different degree of differentiation: primary human hepatocytes (PHH), hepatoma cell lines (HepG2, Huh7, differentiated and undifferentiated HepaRG cells) and low differentiated hepatocyte cell line Pop10. Synthesis of new viral DNA was first detected postnatally, in the first postnatal week, though a transcript was present before. Low levels of pgRNA were detectable beginning at ED 12.5, but HBV core protein was first seen at ED 18.5 and large envelope protein not before birth. All markers of viral replication increased continuously along with liver development and achieved levels of adult animals between week two and four postnatally. In vitro, efficiency of HBV replication, as measured by release of enveloped HBV progeny, was highest in PHH and increased upon differentiation of HepaRG cells. Expression of HBV pgRNA correlated closely with efficiency of HBV replication and hepatocyte differentiation. Levels of HNF4alpha, HNF1alpha and HNF3gamma were highest in PHH, which replicated HBV most efficiently, and lowest in Pop10 cells, in those no expression of pgRNA and HBV replication could be detected. Expression levels of HNF4alpha, HNF1alpha and HNF3gamma increased upon differentiation of HepaRG cells. Knock-down of HNF4alpha and HNF1alpha, but not HNF3gamma resulted in a significant decrease of HBV gene expression, inhibition of HBV replication, accumulation of cccDNA and release of HBV progeny. In addition, expression levels of HNF4alpha, HNF1alpha and PGC-1alpha closely correlated with markers of HBV replication during liver development. In HBV-transgenic mice, HBV replication starts after birth, although transcription of HBV pregenomes is detectable at early stages of fetal liver development. Efficiency of HBV replication parallels liver maturation, suggesting that differentiation of hepatocytes determines the starting point of virus replication. In vivo, in transgenic mice, as well as in vitro, in cells of hepatocyte origin, HBV replication strongly depends on hepatocyte differentiation with HBV pgRNA being the limiting step. High expression levels of HNF4alpha and HNF1alpha are essential for efficient HBV replication. Levels of HNF4alpha in concert with those of HNF1alpha and PGC1alpha link HBV replication to hepatocyte differentiation and are responsible for the late onset and dynamics of HBV replication during liver development. The results of this study provide new insights into virus-host cell interaction that will be helpful for the generation of new models of HBV infection, for the development of therapeutics against HBV and prophylaxis against intrauterine infection with the virus. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Quasdorff, Maria mquasdorff@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-25671
Date:	2008
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HBV , hepatozytaere Differenzierung , Transkriptionsfaktor , vertikale Übertragung German HBV , hepatocyte differentiation , transcription factor , vertical transmission English
Date of oral exam:	14 October 2008
Referee:	Name Academic Title Knebel-Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr. rer. nat.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2567