Massenspektrometrische Charakterisierung endogener Wachstumshormonvarianten und Entwicklung einer Methode zum Nachweis rekombinanten Wachstumshormons in humanem Plasma mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese zum Einsatz in der Dopinganalytik

Kohler, Maxie (2009). Massenspektrometrische Charakterisierung endogener Wachstumshormonvarianten und Entwicklung einer Methode zum Nachweis rekombinanten Wachstumshormons in humanem Plasma mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese zum Einsatz in der Dopinganalytik. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Humanes endogenes Wachstumshormon wird in der Hypophyse produziert und ist einer der wichtigsten Wachstumsregulatoren im menschlichen Körper. Außerdem hat Wachstums¬hormon eine Fülle metabolischer Funktionen wie Fettabbau und Muskelaufbau und hat Einfluss auf den Knochen- sowie Mineralstoffhaushalt. Besonders aufgrund der endokrino¬logischen Wirkungen auf Lipolyse und Proteinanabolismus wird Wachstums¬hormon im Sport zur Leistungssteigerung eingesetzt, und dessen Verwendung ist von der Welt Anti-Doping Agentur (WADA) verboten. Endogenes Wachstumshormon ist ein heterogenes Protein und besteht aus vielen Varianten und Fragmenten. Die Hauptform, die etwa 90% des Wachstumshormons im Körper ausmacht, ist 22 kDa groß und entspricht dem rekombinanten Wachstumshormon. Andere bereits identifizierte Formen sind eine 20 kDa Splice-Variante, phosphorylierte und deamidierte Formen und Fragmente sowie Polymere. Eine Testmethode zur Detektion rekombinanten Wachstumshormons muss daher die niederkonzentrierten, für endogenes Wachstumshormon spezifischen Formen detektieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Dopingkontrollmethode entwickelt, die Wachstumshomon aus humanem Plasma durch Immunoaffinitätsaufreinigung, 2D-Elektrophorese und Immunoblot detektiert und die Unterscheidung von endogenem und rekombinantem Wachstumshormon ermöglicht. Des Weiteren wurden die in der Methode detektierten endogenen Formen mittels hochauflösender/hochakkurater Massenspektrometrie identifiziert. Die Immunoaffinitätsaufreinigung dient zur Isolation des Wachstumshormons und des zugegebenen internen Standards (plazentares Laktogen) mittels eines polyklonalen anti-Wachstumshormon-Antikörpers und, an einen sekundären Antikörper gekoppelten, magnetischen Beads. Nach Auftrennung mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese werden die Proteine mittels Immunoblot und Chemilumineszenzreaktion visualisiert. Die Prozedur detektiert bis zu vier endogene Wachstumshormonvarianten, erlaubt die Analyse von sechs Proben in einer Aufarbeitung und nimmt 2 ½ Tage in Anspruch. Die Methode wurde unter Berücksichtigung der analytischen Parameter Spezifität, Linearität, Nachweisgrenze (0,3 ng/ml), Präzision (14%) und Wiederfindung (30%) validiert. Der Einfluss einer belastungsinduzierten Wachstumshormonausschüttung auf die Detektion unterschiedlicher Varianten wurde mittels eines Belastungstests geprüft und ergab keine Diskriminierung endogener Formen. Um Grenzwerte für die Präsenz rekombinanten Wachstumshormons in einer Probe festlegen zu können wurden Proben einer Referenzgruppe gesunder Probanden sowie Proben von Patienten gemessen, die rekombinantes Wachstumshormon applizieren. Aus der Referenzpopulation wurde ein Unterscheidungslimit von 0,52 für das auf den internen Standard normierte Spotvolumen der 22 kDa-Hauptform errechnet. Proben mit einem normierten Spotvolumen der 22 kDa-Hauptform > 0,52 müssen, wenn sie endogenes Wachstumshormon enthalten, mindestens eine weitere Form (die 20 kDa Splice-Variante) zeigen. Ist dies nicht der Fall, wird die Schlussfolgerung gezogen, dass die Probe rekombinantes Wachstumshormon enthält. Die Werte der analysierten Patientenproben lagen weit über dem Unterscheidungslimit und konnten eindeutig als Proben identifiziert werden, die rekombinantes Wachstumshormon enthalten. Der entwickelte Test ist damit eine wertvolle Ergänzung und sollte als Bestätigungsmethode zu dem bisher verwendeten Immunoassay eingesetzt werden. Die massenspektrometrische Identifizierung konzentrierte sich auf die vier endogenen Spots, die in der Dopingkontrollmethode detektiert werden. Diese wurden identifiziert als 1) 22 kDa-Hauptform, 2) 20 kDa Splice-Variante, 3) phosphorylierte Form mit Modifikationen an Serin 106 und 150 und 4) einer glykosylierten Form, die vermutlich an Threonin 60 modifiziert ist. Die Glykosylierung ist eine O-Glykosylierung vom Mucin-Typ und die Strukur wurde als Verknüpfung einer Hexose (Hex) mit einem N-acetylierten Hexosamin (HexNac) und zwei Sialinsäuren (NeuAc) identifiziert. Zusätzlich wurden Fragmente mit 9 und 12 kDa sowie unterschiedliche oxidierte Formen detektiert. Die massenspektrometrische Charakterisierung von Varianten und Isoformen, die in einer auf immunologischen Techniken beruhenden Methode detektiert werden, ist entscheidend, um Ergebnisse bewerten und ungewöhnliche Werte besser einordnen zu können. Des Weiteren kann die Identifizierung neuer Varianten eines Proteins zur Aufklärung von Funktionen und Signalwegen beitragen. Damit sind die hier vorgestellten Ergebnisse sowohl für die Dopinganalytik als auch für die Endokrinologie sehr bedeutsam.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Mass spectrometric characterization of endogenous growth hormone variants and development of a detection method for recombinant growth hormone in human plasma by two-dimensional gel electrophoresis for doping control purposes	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Human endogenous growth hormone is produced in the pituitary and is one of the most important growth-promoting factors in the human body. Besides, it has several important metabolic functions such as lipolysis, protein anabolism, regulation of bone metabolism and has influence on the immune system and mineral balance. Due to those endocrinological properties and mainly the improvement of the muscle-to-fat ratio, growth hormone is used as performance enhancing agent by athletes, and the use is prohibited by the World Anti-Doping Agency (WADA). Endogenous human growth hormone consists of several variants and isoforms with a 22 kDa-variant being the main growth hormone isoform. Beside that, a splice variant as well as e.g. phosphorylated or deamidated variants and fragments or polymers were detected. The 22 kDa-isoform accounts for about 90% of total growth hormone in the body and is identical to the homogenous recombinant growth hormone. Therefore, a test method needs to detect and evaluate low concentrated endogenous variants that are not present in the recombinant protein. The presented work was carried out to develop a method to detect recombinant human growth hormone from plasma samples by immunoaffinity purification, two-dimensional gel electrophoresis and immunoblotting. Additionally, the detected endogenous variants were identified by high resolution/high accuracy mass spectrometry. The method uses a polyclonal anti-growth hormone antibody and a secondary antibody, which is coupled to magnetic beads to isolate growth hormone from 1 mL of plasma. Additionally, an internal standard (placental lactogen) is added prior to the immunoaffinity purification. After 2D-electrophoresis proteins are visualized by immunoblotting and chemiluminescent detection. The whole procedure takes 2.5 days and allows the simultaneous preparation of six samples. The method was validated regarding the analytical parameters specificity, linearity, limit of detection (0.3 ng/ml), precision (14%) and recovery (30%). The influence of an exercise-induced growth hormone release was tested and found not to affect the analysis by discriminating isoforms. To prove the performance of the method to differentiate endogenous from recombinant growth hormone, a reference population was tested and discrimination limits in the form of normalized spot volumes of the main 22 kDa spot on the membrane were determined. Samples with a normalized spot volume of > 0.52 of the main spot (and therefore the main growth hormone variant) need to show at least one additional growth hormone variant on the blot. If not, it is evaluated as containing recombinant growth hormone. Plasma samples from patients with growth hormone deficiency or idiopathic short stature that need to inject recombinant growth hormone were clearly positive and fulfilled the criteria defined from the reference group data. The test is a valuable complementation to the analysis currently used and should be implemented as confirmation test. The mass spectrometric characterization of growth hormone was focused on the four endogenous spots that are detected by the doping control method. Those were identified as 1) the 22 kDa main isoform, 2) a 20 kDa splice variant, 3) a phosphorylated variant with modifications at Ser 106 or Ser 150 and 4) a glycosylated variant being glycosylated presumably at threonine 60. The glycosylation is a mucin-type O-glycosylation and was identified to consist of a hexose (Hex), a N-acetylated hexosamine (HexNAc) and two sialic acid residues (NeuAc). Additionally, fragments of 9 and 12 kDa as well as different oxidation products were identified. The characterization of variants that are detected by an immunological method is essential to enable the evaluation of results and atypical findings. Furthermore, the characterization of new isoforms, as for example the glycosylation, can clarify functions of growth hormone, and endocrinolgical studies may follow to identify further functions or metabolic pathways. Therefore the conducted studies are important for anti-doping research as well as for endocrinologists and clinical applications.

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