Universität zu Köln

Schievenbusch, Stephanie (2009). HGF as a multifunctional anti-fibrotic agent with high impact on gene therapy for renal interstitial fibrosis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Fibrotic processes in chronic kidney diseases are the leading cause of renal failure. Hepatocyte growth factor (HGF), effecting organ restructuring by its mitogenic, motogenic, morphogenic and anti-apoptotic activities, is one of the central mediators involved in tubular repair and regeneration after acute renal injury. In addition, HGF acts as an anti-inflammatory and anti-fibrotic factor antagonizing pro-fibrotic actions of transforming growth factor beta (TGF-beta). However, the molecular and cellular mechanisms underlying the anti-fibrotic function of HGF in chronic kidney disease are not well understood. Therefore, in the present study HGF signaling and HGF induced expression profiles were studied in renal interstitial fibroblasts that represent a central cell type in tubulointerstitial fibrosis due to their prominent production of extracellular matrix proteins. Furthermore, gene therapeutical HGF application using different serotypes of the adeno-associated viral vector (AAV), namely AAV2, AAV8 and AAV9, was tested in order to treat tubulointerstitial fibrosis in a COL4A3 knockout mouse model. Analyses of HGF signaling demonstrated that in agreement to signaling in epithelial cells HGF stimulation results in the activation of the Erk1/2 and the Akt pathway. However, the Stat3 signal transducer was not phosphorylated. Smad2/3 phosphorylation in response to Erk1/2 activation in HGF stimulated fibroblasts supports previous data showing the antagonistic interaction of the HGF- and TGF-beta-signaling. A comprehensive expression profiling of HGF-stimulated renal fibroblasts by microarray hybridisation could further define the anti-fibrotic signals mediated by HGF. Functional cluster analyses and quantitative PCR assays indicated that the HGF-stimulated pathways transfer the anti-fibrotic effects in renal interstitial fibroblasts by reducing expression of extracellular matrix roteins, various chemokines, and members of the CCN family. Interruption of the HGF signaling via the Akt pathway or support of the HGF signaling via the Erk1/2 pathway by RNA interference, using Akt-siRNA or Smad4-siRNA, proved that not only Erk1/2 activation but also Akt activation is responsible for anti-fibrotic signal transduction by HGF. These data clearly point out that the Akt signaling upon HGF stimulation acts as an auxiliary pathway in the anti-fibrotic function of HGF. In order to apply the anti-fibrotic effect of HGF to chronic kidney diseases, a gene therapeutical system was established, intended to reduce renal interstitial fibrosis by the use of HGF as transgene and the adeno-associated viral vector (AAV) as gene vehicle. COL4A3 knockout mice mimicking the human Alport syndrome served as model system for renal tubulointerstitial fibrosis. Different natural occurring AAV serotypes, namely AAV2, AAV8 and AAV9, were studied with regard to their capability to target renal epithelial cells compared to liver parenchyma. Furthermore, a mammalian promoter construct was generated that restricted transgene expression to the kidney and the liver for a combined endocrine and paracrine expression of HGF. Systemic application of AAV8 and AAV9 carrying HGF as transgene resulted in high serum levels of HGF in COL4A3 knockout mice, however, AAV9 achieved the highest HGF expression in both the liver and the kidney. HGF serum levels were associated with pronounced repression of fibrotic markers such as collagen1A1, PDGF-receptor-beta, and alpha-smooth-muscle actin. In addition, AAV mediated HGF expression resulted a remarkable reduction in the severity of fibrosis. In conclusion, HGF is a promising anti-fibrotic agent for the treatment of chronic kidney diseases. Additionally, this study established a proof-of-concept of AAV-based therapy as a promising vector platform to treat chronic kidney diseases.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language HGF als multifunktionelles antifibrotisches Agens mit hoher gentherapeutischer Wirkung in der tubulointerstitiellen Fibrose German HGF as a multifunctional anti-fibrotic agent with high impact on gene therapy for renal tubulointerstitial fibrosis English
Translated abstract:	Abstract Language Fibrotische Prozesse spielen bei chronischen Nierenerkrankungen eine entscheidende Rolle, da sie die Hauptursache für das terminale Nierenversagen darstellen. Ein wichtiger Wachstumsfaktor in diesem Prozess ist HGF (hepatocyte growth factor). HGF beeinflußt die Organ-Umstrukturierung sowohl durch seine mitogenen, motogenen, morphogenen sowie anti-apoptotischen Eigenschaften. Er ist ein zentraler Regenerationsfaktor des Tubulusepithels nach akuter Nierenschädigung. Darüber hinaus weist HGF auch antiinflammatorische sowie anti-fibrogene Eigenschaften auf, indem er dem pro-fibrogenen Faktor transforming growth factor beta (TGF-beta) entgegenwirkt. Allerdings sind die molekularen und zellulären Mechanismen, die den anti-fibrogenen Eigenschaften von HGF zu Grunde liegen, noch nicht vollständig untersucht. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion von HGF sowie die durch HGF induzierten Expressionsprofile in interstitiellen Nierenfibroblasten analysiert. Dieser Zelltyp spielt in der interstitiellen Fibrose eine entscheidende Rolle, da er für die ausgeprägte Produktion von extrazellulären Matrixproteinen hauptverantwortlich ist. Des Weiteren stellt diese Arbeit einen gentherapeutischen Ansatz für die Applikation von HGF mittels adeno- assoziierter viraler Vektoren (AAV) dar. Dafür wurden verschiedene Serotypen des AAV (AAV2, AAV8 und AAV9) hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, als Genvehikel für die Behandlung von tubulointerstitieller Fibrose in einem Mausmodell (COL4A3) eingesetzt zu werden. Die Analysen auf Ebene der Signaltransduktion von HGF in interstitiellen Nierenfibroblasten zeigten in Übereinstimmung mit Untersuchungen in epithelialen Zellen eine Aktivierung des Erk1/2 und des Akt Signalweges, wohingegen Stat3 unbeeinflußt von HGF blieb. Die durch Erk1/2 hervorgerufene Phosphorylierung von Smad2/3 in HGF stimulierten Fibroblasten bestätigt frühere Daten, welche die antagonistische Wirkung von HGF auf die Interaktion mit dem TGF-beta Signalweg zurückführen. Umfassende Expressionsanalysen der HGF stimulierten Nierenfibroblasten mittels Microarray Hybridisierung konnten darüber hinaus die antifibrogenen Signale von HGF weiter verifizieren. Funktionelle Cluster-Analysen sowie quantitative PCR Assays deuten darauf hin, daß in interstitiellen Nierenfibroblasten die antifibrogenen Effekte von HGF auf einer verminderten Expression von extrazellulären Matrixproteinen, Chemokinen und extrazellulärer Matrix-assoziierten Proteinen (CCN-Familie) beruht. Die Blockade der HGF Signaltransduktion über den Akt-Weg bzw. die Verstärkung der HGF Signaltransduktion über den Erk1/2 Weg mittels RNA Interferenz (Akt-siRNA bzw. Smad4-siRNA) konnte darüber hinaus zeigen, daß die anti-fibrogenen Signale von HGF nicht nur über den Erk1/2 Weg und der damit einhergehenden Interaktion mit Smad2/3 vermittelt werden. Auch die Signaltranduktion über den Akt-Weg spielt eine entscheidende Rolle, womit diese Daten deutlich zeigen, daß die HGF-stimulierte Akt-Signalkaskade einen zusätzlichen Weg in der anti-fibrogenen Antwort von HGF einnimmt. Um die anti-fibrogenen Eigenschaften von HGF ebenfalls in vivo auf chronische Nierenerkrankungen zu übertragen, wurde ein gentherapeutisches System etabliert, welches die interstitielle Nierenfibrose vermindern sollte. Hierfür wurden verschiedene Serotypen des adeno-assoziierten viralen Vektors (AAV) als Vehikel für den Gentransfer von HGF eingesetzt. Das COL4A3 knockout Mausmodell diente hierfür als in vivo Modell, welches das humane Alportsyndrom widerspiegelt und eine interstitielle Nierenfibrose entwickelt. Drei natürlich vorkommende Serotypen des AAV, AAV2, AAV8 und AAV9, wurden hinsichtlich ihrer Transduzierbarkeit von Nierenepithelzellen sowie Leberparenchymzellen untersucht. Des Weiteren wurde ein Promotorkonstrukt generiert, welches die Expression des Transgens auf die Niere und die Leber begrenzt um eine endokrine sowie parakrine Expression von HGF zu gewährleisten. Sowohl der Gentransfer von HGF mittels AAV8 als auch AAV9 führte zu einem starken Anstieg der HGF Serumlevel in COL4A3 knockout Mäusen, wobei die Transduktion mit AAV9 die höchste HGF Expression erzielte. Die erhöhten HGF Serumlevel korrelierten mit einer verringerten Expression fibrotischer Marker wie Collagen1A1, PDGF-Rezeptor-beta sowie alpha smooth muscle actin. Darüber hinaus zeigten Mäuse mit erhöhter HGF Expression auch histologisch eine deutlich verringerte Ablagerung extrazellulärer Matrix und somit eine deutlich verminderte Fibrose. Zuammenfassend zeigt diese Studie, daß HGF ein vielversprechender anti-fibrogener Wachstumsfaktor für die Behandlung chronischer Nierenerkrankungen darstellt. Des Weiteren scheint der AAV9 Vektor ein vielversprechender viraler Vektor für den intravenösen Gentransfer zu sein, der eine stabile Langzeit-Expression ermöglicht. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schievenbusch, Stephanie stephanie.schievenbusch@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-30442
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Management, Economy and Social Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Management, Economy and Social Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HGF , Nierenfibrose , AAV German HGF , renal fibrosis , AAV English
Date of oral exam:	1 July 2009
Referee:	Name Academic Title Nischt, Roswitha PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3044