Role of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in chronic lymphocytic leukemia (CLL): Implications to overcome the apoptotic block

Gehrke, Iris (2010). Role of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in chronic lymphocytic leukemia (CLL): Implications to overcome the apoptotic block. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is an incurable disease, which is characterized by an accumulation of monoclonal CD5/CD19/CD23-positive B-lymphocytes, which exhibit a functional apoptotic block. The vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent mitogen with the capacity to induce angiogenesis by stimulation of vascular endothelial cells. It has been suggested that VEGF has an angiogenesis-independent role in hematological diseases. Also, CLL cells could be shown to express and secrete VEGF and to feature VEGF-receptors (VEGF-R). Despite their apoptotic-resistance in vivo, CLL cells die within a few days when taken out of their natural microenvironment and are placed under cell culture conditions, strongly suggesting the bone marrow and peripheral blood to be of critical importance in the prevention of apoptotic CLL cell death in vivo. As for example bone marrow stromal cells produce and secrete VEGF, a paracrine feedback loop might be involved in the apoptotic resistance CLL cells feature in vivo. The aim of this investigation was to elucidate the role of VEGF in the apoptotic resistance of CLL cells, especially in the background of a microenvironmental influence and therefore, to discover potential targets for a CLL cell specific therapeutic approach. In this study it could be demonstrated that CLL cells, but not healthy B-cells express the most common VEGF isoforms and exhibit a phosphorylated VEGF-receptor 2 (VEGF-R2). Phosphorylation was lost with time under cell culture conditions and went along with a loss of the apoptotic resistance. Since addition of rhVEGF increased levels of anti-apoptotic proteins, but did not significantly influence CLL cell survival in vitro, it can be concluded that VEGF has pro-survival functions, but requires further components derived from the microenvironment to achieve full apoptotic protection as present in vivo. Therefore, CLL cells were cocultured together with the bone marrow-derived stromal cell line HS5, which produced and secreted high levels of VEGF. This resulted in maintenance of the phosphorylated receptor status and a prolonged survival of the CLL cells in vitro. Interestingly, healthy B-cells, which only express low levels of VEGF-R2, did not profit from coculture with HS5 in terms of survival. The essential role of VEGF in HS5-mediated survival-support could be demonstrated, as neutralization of VEGF in CLL/HS5 coculture using a monoclonal VEGF antibody significantly reduced the survival advantage. In this study it could further be demonstrated that paracrine VEGF, derived from bone marrow stromal cells, rather than CLL cell-derived VEGF is essential, as downregulation of VEGF in HS5 cells by siRNA almost completly abolished the coculture-mediated survival support for CLL cells. As a possible mechanism of VEGF-mediated survival support the activation of signal transducer and activator of transcription (STAT) 3 via tyr705 phosphorylation could be demonstrated. This phosphorylation was induced by addition of recombinant human VEGF to CLL cell monoculture as well as by cocultivation with HS5 cells and was reversible by addition of a VEGF-R inhibitor. The activation of STAT3 could be demonstrated by an upregulation of the known STAT3 targets BclXL and cyclinD1. The known downstream effector of the VEGF-R2 Akt was neither phosphorylated upon rhVEGF stimulation nor by HS5 coculture. The VEGF/VEGF-R/STAT3 axis can therefore be considered a suitable target for a therapeutic intervention. The tested monoclonal antibody MAb293 and the VEGF-R inhibitor GW 786034 significantly reduced the survival advantage CLL cells gained from HS5 coculture. The selected STAT3-inhibitor was effective in high concentrations after long incubation times with limited selectivity. In conclusion, it can be proposed that VEGF action is indispensable in a multipart pro-survival complex involving STAT3 and subsequent expression of pro-survival factors in CLL cells. The VEGF/VEGF-R/STAT3 pathway might therefore be a promising target for selective therapeutic approaches in CLL

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Die Rolle des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) in der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL): Möglichkeiten zur Überwindung des apoptotischen Blocks	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist eine unheilbare Erkrankung, die sich durch eine Akkumulation monoklonaler CD5/CD19/CD23-positiver B-Lymphozyten auszeichnet, deren Fähigkeit zur Apoptose in vivo hochgradig reduziert ist. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) ist ein potentes Mitogen, welches durch Stimulation von Gefäßendothelien Angiogenese auslöst. Es wird angenommen, dass VEGF bei hämatologischen Erkrankungen eine Angiogenese-unabhängige Funktion besitzt. Auch CLL-Zellen exprimieren und sezernieren VEGF und weisen VEGF-Rezeptoren auf. Trotz ihrer Apoptoseresistenz in vivo sterben CLL-Zellen, die aus ihrer Umgebung im Blut oder Knochemark isoliert werden, innerhalb weniger Tage in vitro ab, weswegen dem natürlichen Mikromilieu der CLL-Zellen eine wichtige Funktion bei der apoptotischen Resistenz zugeschrieben wird. Da Knochemarkstromazellen etwa VEGF produzieren, könnte eine parakrine VEGF-Rückkopplung an der Verhinderung des Zelltodes der CLL-Zellen in vivo beteiligt sein. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Rolle von VEGF beim apoptotischen Block der CLL-Zellen, insbesondere im Hinblick auf den Einfluss des Mikromilieus zu untersuchen und dadurch potentielle Angriffspunkte für eine zielgerichtete Therapie aufzudecken. Es konnte gezeigt werden, dass CLL-Zellen im Gegensatz zu gesunden B-Zellen verschiedene VEGF-Isoformen produzieren und phosphorylierte VEGF-Rezeptoren 2 (VEGF-R2) aufweisen. Diese Phosphorylierung ging mit der Zeit in Kultur verloren, was mit einem Verlust der Apoptoseresistenz assoziiert war. Da eine Zugabe von rekombinantem VEGF (rhVEGF) zu einer verstärkten Expression anti-apoptotischer Proteine führte, das Überleben der CLL-Zellen in vitro jedoch nicht verbessern konnte, kann davon ausgegangen werden, dass weitere Komponenten des Mikromilieus benötigt werden um eine vollständige Verhinderung von apoptotischem Zelltod, wie sie in vivo vorhanden ist, zu erzielen. CLL-Zellen wurden deswegen zusammen mit der Knochenmarkstromazelllinie HS5, welche VEGF exprimiert und sezerniert, kultiviert. Dies führte zu einer Aufrechterhaltung der VEGF-R2-Phosphorylierung und einem deutlich verbesserten Überleben der CLL-Zellen. Gleichzeitig profitierten gesunde B-Zellen, welche den VEGF-R2 nur in sehr geringen Mengen aufweisen, nicht von einer Kokultur mit HS5. Die entscheidende Rolle von VEGF bei der Kokultur-vermittelten Überlebensverbesserung der CLL-Zellen wurde dadurch bestätigt, dass eine Blockierung des VEGF-Signalweges durch Zugabe eines VEGF-neutralisierenden Antikörpers zu einem reduzierten Überlebensvorteil führte. Zudem konnte gezeigt werden, dass ein parakriner Effekt essentiell ist, da eine siRNA-vermittelte Herunterregulierung von VEGF in HS5-Zellen den Überlebensvorteil der CLL-Zellen fast komplett aufheben konnte. Als ein möglicher Mechanismus des VEGF-vermittelten Überlebens der CLL-Zellen konnte eine Aktivierung des signal transducers and activators of transcription (STAT) 3 durch Tyr705-Phosphorylierung gezeigt werden. Diese wurde durch Zugabe von rhVEGF in einer CLL-Monokultur und durch Kokultivierung mit HS5-Zellen hervorgerufen und konnte durch gleichzeitige Zugabe eines VEGF-R-Inhibitors wieder rückgängig gemacht werden. Die Aktivierung von STAT3 wurde durch eine Hochregulierung der STAT3 Zielgene BclXL und CyclinD1 nachgewiesen. Der bekannte intrazelluläre Signalmediator des VEGF-Rezeptors Akt zeigte weder nach exogener VEGF Stimulation noch nach HS5-Kokultur eine verstärkte Phosphorylierung. Die VEGF/VEGF-R/STAT3-Achse eignet sich demnach als potentieller Angriffspunkt für einen zielgerichteten Therapienasatz. Sowohl der monoklonale anti-VEGF Antikörper MAb293, als auch der VEGF-R-Inhibitor GW 786034 reduzierten das Überleben der CLL-Zellen in einer überlebensfördernden Kokultur mit HS5-Zellen signifikant. Der ausgewählte STAT3-Inhibitor war in hohen Konzentrationen und nach langer Inkubationszeit wirksam und begrenzt selektiv. Zusammenfassend kann VEGF als ein essentieller Bestandteil eines überlebensfördernden Zusammenspiels der CLL-Zelle mit ihrem Mikromilieu beschrieben werden, bei dem die Aktivierung von STAT3 eine Rolle spielt. Der VEGF/VEGF-R/STAT3 Signalweg ist demnach ein viel versprechendes Ziel für eine therapeutische Intervention in der CLL.

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