Universität zu Köln

Der plazentale Wachstumsfaktor (PlGF), ein Mitglied der Familie der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF), ist bekannt als wichtiger Mediator für die Regulation des Gefäßwachstums während des Gewebeumbaus. Dies gilt in besonderem Maße für die Hautregeneration und Karzinogenese. Ähnlich wie für VEGFA gezeigt, wird die Expression von PlGF durch alternatives mRNA Splicing eines plgf- Gens reguliert, und führt zur Bildung von verschiedenen Proteinisoformen. Diese unterscheiden sich maßgeblich durch alternative Expression einer stark basischen Domäne am Carboxylende des Proteins (Heparin-bindende Domäne). Bei den am häufigsten exprimierten Isoformen handelt es sich um PlGF-1 (ohne Heparin-bindende Domäne) und PlGF-2 (mit Heparin-bindender Domäne). Die Funktion der Heparin-bindenden Domäne von VEGF-A165 war in den letzten Jahren Forschungsgegenstand zahlreicher Untersuchungen, durch deren Ergebnisse die essentielle Rolle der Heparin-bindenden Domäne für die Aktivität von VEGF-A165 gezeigt werden konnte. Die Funktion der Heparin-bindenden Domäne von PlGF-2 hingegen blieb trotz hoher Sequenzhomologie zu VEGF-A165 (46%) bis heute weitgehend ungeklärt. Um die strukturellen und funktionellen Unterschiede zwischen rhPlGF-1 und rhPlGF-2 näher zu untersuchen, wurden diese Isoformen in HEK293 Zellen exprimiert und in verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten charakterisiert. Untersuchungen der Proteasesensitivität von rhPlGF-2 ergaben, dass PlGF ein Zielprotein der Serinprotease Plasmin ist. Die daraus resultierende C-terminale Fragmentierung wurde mit Hilfe von Western Blot und MALDI-TOF-Massenspektroskopischer Analyse untersucht. Neben mehreren Schnittstellen innerhalb der Heparin-bindenden Domäne, konnte Lys118-Met119 als die am weitesten N-terminal gelegene spezifische Plasminschnittstelle identifiziert werden. Um die funktionellen Konsequenzen dieser proteolytischen Prozessierung von rhPlGF-2 näher zu untersuchen, wurde eine verkürzte Form von rhPlGF (PlGFStop) generiert, welche den plasminresistenten, Nterminalen Bereich von PlGF umfasst (Leu1-Lys118). Vergleichende Untersuchungen von rhPlGF-1, rhPlGF-2 und rhPlGFStop bezüglich ihrer chemotaktischen Aktivität und ihrer Fähigkeit eine Gefäßaussprossung zu fördern, zeigten signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen PlGF Isoformen auf. Während rhPlGF-2 eine deutliche chemotaktische Antwort in HUVE Zellen und Neurpilin-1-transfizierten Endothelzellen aus der Aorta des Schweins hervorrief und die Ausbildung von gefäßähnlichen Strukturen induzierte, zeigten sowohl rhPlGF-1, Plasmin-prozessiertes rhPlGF-2 als auch die mutierte Form rhPlGFStop eine klar verminderte Aktivität. Weiterhin förderte die topische Applikation von rhPlGF-2 in Wunden von diabetischen Mäusen mit verzögerter Wundheilung eine signifikante Zunahme an vaskularisiertem Granulationsgewebe. Im Gegensatz dazu, wiesen rhPlGF- 1 und rhPlGFStop nur geringe Effekte auf. Zusammenfassend konnten die Ergebnisse eine klare Funktionalität der Heparin-bindenden Domäne von rhPlGF-2 aufzeigen, zum einen durch die Stimulation endothelialer Zellfunktionen in vitro und zum anderen durch angiogenesefördernde Effekte in vivo. Um die zugrunde liegenden Mechanismen für die gesteigerte Bioaktivität von PlGF-2 zu identifizieren, wurde sowohl die Bindung der unterschiedlichen PlGF Isoformen an verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix und an den Korezeptor Nrp-1 gemessen, als auch mögliche Signaltransduktionswege untersucht. Mit Hilfe von Surface Plasmon Resonance Spektroskopie wurde gezeigt, dass sowohl rhPlGF-2 als auch – unerwarteter Weise rhPlGF-1 - eine starke Affinität für verschiedene untersuchte Glykosaminoglykane (GAGs) aufweisen (Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat). Diese Ergebnisse lassen vermuten, das die Interaktion zwischen PlGF und den untersuchten GAGs hauptsächlich durch die von Exon 7 codierten Aminosäuren vermittelt wird, welche in beiden Isoformen expremiert werden. Die Heparin-bindenden Domäne in PlGF-2 scheint nicht essentiell für eine Bindung an die untersuchten GAGs zu sein. Zusätzlich konnte eine moderate Bindung von rhPlGF-2 an Nrp-1 gemessen werden, die jedoch in Anwesenheit von Heparin signifikant um den Faktor 100 verstärkt wurde. Das Fehlen der C-terminalen Domäne (kodiert von Exon 6 und 7) in rhPlGFStop führte zu einem vollständigen Verlust der Bindungskapazität in allen durchgeführten Messungen. Diese C-terminale Verkürzung des Proteins scheint jedoch keinen maßgeblichen Einfluss auf die Bindung an den VEGFR-1 zu haben. Nach Stimulation mit rhPlGFStop oder rhPlGF-2 zeigten sowohl VEGFR-1, als auch die nachgeschalteten Signalproteine Akt und Erk-1/-2 eine vergleichbare Phosphorylierung. Eine weiterführende Analyse möglicher Signaltransduktionswege in Endothelzellen lässt darauf schließen, dass die durch rhPlGF-2 induzierte verstärkte endotheliale Zellaktivität teilweise durch eine Aktivierung der Tyrosinkinasen FAK (focal adhesion kinase) und Src vermittelt sein könnte. Zusätzlich konnte eine verstärkte Phosphorylierung dieser Kinasen bei Nrp-1 Überexpression und Collagen I Exposition beobachtet werden. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit neue Funktionen der Heparin-bindenden Domäne von PlGF-2 und der C-terminalen Domäne von PlGF-1 aufgezeigt werden. Die Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die durch Plasmin vermittelte, C-terminale Proteolyse eine Schüsselkomponente für die durch PlGF induzierte Angiogenese darstellt.

German