Interplay between vascular endothelial growth factor-A and extracellular matrix in angiogenesis: molecular and cellular mechanisms

Traub, Stephanie (2011). Interplay between vascular endothelial growth factor-A and extracellular matrix in angiogenesis: molecular and cellular mechanisms. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
Thesis_Traub.pdf
Download (41MB)

Abstract

The induction of angiogenesis by stimulation of physiological vessel growth using pro- angiogenic growth factors is currently under intense investigation in medical research. It is well accepted, that angiogenesis is a rate-limiting step in skin regeneration, as it ensures supply of novel tissue with nutrients and oxygen. Chronic wounds are characterized by a lack of angiogenesis and thus represent a major target for the induction of angiogenesis by therapeutic means. For the delivery of VEGF-A165 to chronic wounds and the induction of effective angiogenesis, in general it is proposed that first, the stabilization of the growth factor against protease activities, and second, the tight control of its release are beneficial. The aim of this study was to optimize wound angiogenesis in non-healing wounds in response to recombinant VEGF-A165 by improving bioavailability and potency of the growth factor. To stabilize the growth factor in the chronic wound environment, recently a mutated form of VEGF-A165 (VEGFmut) resistant to plasmin cleavage was generated in our group. This mutant was used in this study for the analysis of protein delivery. For this purpose, a hybrid protein composed of VEGFmut and a factor XIIIa transglutaminase substrate sequence (TG) was generated. This sequence allows covalent incorporation of the recombinant protein a into fibrin matrix. Furthermore, a second strategy to increase the angiogenic response was investigated which aimed at the stimulation of synergistic signaling downstream of VEGFR-2 and integrin αvβ3. To this end, bi-functional proteins consisting of the fibronectin type III domain 10 (FNIII10) and VEGFmut denoted as FLV were generated for the concomitant activation of both receptors. The recombinant proteins were expressed in E. coli. FNIII10 and TG-FNIII10 were purified as GST-fusion proteins, whereas VEGF-containing constructs were produced in bacterial inclusion bodies, refolded, dimerized, and purified by heparin affinity chromatography. However, purification of the bi-functional proteins was challenging, as they tended to precipitate and dimerization was ineffective. To overcome these problems, in a subsequent approach, FNIII10, TG-FNIII10, VEGFmut, TG-VEGFmut, FLV and TG-FLV were expressed in eucaryotic cells (HEK293-EBNA) and purified by a C-terminal poly-histidine tag. The biological activity of these proteins was confirmed in various in vitro assays. First, HUVECs were shown to attach to TG-FNIII10 in a concentration dependent manner, and this attachment was reduced by integrin αvβ3 function-blocking antibodies. Second, recombinant proteins fused to a TG sequence were covalently incorporated into fibrin gels by the activity of factor XIIIa, and were retained by up to 90 % after two days of washing, whereas their soluble counterparts were released in a burst release during the first 8 hours. Third, the biological activity of the VEGF-variants was shown in vitro by their ability to induce VEGFR-2 phosphorylation in HUVECs by western blot analysis and ELISA. Intriguingly, the bi-functional protein FLV failed to induce detectable synergistic signaling on the receptor level when it was added to HUVECs. In contrast, when HUVECs were seeded on microscopy slides coated with the recombinant proteins, FLV promoted attachment and spreading to a higher degree than FNIII10 or VEGFmut alone. Together, these findings indicate that the immobilized proteins show different potential in the induction of cellular responses. The potency of these proteins to induce angiogenesis was also assessed in vivo using wound healing as a model. Fibrin gels containing 0.468 µM (corresponding to 20 µg/mL effective VEGF-concentration) of either VEGFmut, TG-VEGFmut, TG-FLV or no recombinant protein were applied to full-thickness punch biopsy wounds created on the back of db/db mice, which are used as a model of impaired wound healing. When compared to fibrin treatment only, wound closure was accelerated upon treatment with various VEGF-proteins. More important, both TG-VEGF and TG-FLV proved to be significantly more potent in inducing blood vessel growth into the wound area, when compared to soluble VEGFmut. Differences between the two TG- isoforms were observed in the maturity of neovessels as indicated by the recruitment of pericytes: pericyte recruitment was more efficient in fibrin/TG-VEGF treated wounds than in fibrin/TG-FLV treated wounds at day 10. Collectively, the findings of this study support a critical role for the interplay between VEGF-A and extracellular matrix during wound angiogenesis, and suggest that protein engineering provides a novel molecular approach to use these interactions for therapeutic angiogenesis.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Im klinischen Alltag sind chronische Wundheilungsstörungen ein häufiges Krankheitsbild, dem eine Fehlregulation der Angiogenese in Folge eines proteasereichen Mikromilieus zugrunde liegt. Die Stimulation der Angiogenese durch therapeutische Maßnahmen stellt daher eine vielversprechende Behandlungsoption dar. Ziel dieser Arbeit war es, die durch VEGF-A165 stimulierte Angiogenese in chronischen Wunden zu optimieren. In dieser Arbeit wurde die Fragestellung bearbeitet, ob die Stabilisierung von VEGF-A gegen in der Wunde angereicherte Proteasen, sowie die räumlich und zeitlich kontrollierte Verfügbarkeit des Wachstumsfaktors der Wundheilung förderlich sind. Eine Mutation im VEGF-A165 Protein (VEGFmut) verhindert den Abbau durch Plasmin in chronischen Wunden, wie unsere Arbeitsgruppe bereits in früheren Untersuchungen zeigen konnte. Die Verfügbarkeit von VEGFmut kann über die kovalente Bindung an Fibrin kontrolliert werden. Zu diesem Zweck wurde ein Fusionsprotein generiert, welches VEGFmut an die Substratsequenz für Faktor XIIIa koppelt (TG-VEGFmut). Um die Angiogenese darüber hinaus zu verstärken, wurde ein weiteres bifunktionales Fusionsprotein hergestellt, welches VEGFmut über einen Linker mit der Fibronektin Typ III Domäne 10 (FNIII10) verbindet und somit simultan an den VEGF-Rezeptor 2 und das Integrin αvβ3 binden soll. Dieses Fusionsprotein FNIII10-Linker-VEGFmut (FLV) soll einen synergistischen Effekt in Folge der Kostimulation von VEGF-Rezeptor 2 und Integrin αvβ3 erzielen. Die rekombinanten Proteine wurden zunächst in E. coli exprimiert. FNIII10 und TG-FNIII10 wurden als GST-Fusionsproteine aufgereinigt, während die VEGFmut-basierten Proteine aus bakteriellen Inklusionskörperchen gewonnen und über ihre Heparinaffinität aufgereinigt wurden. Insbesondere für die bifunktonalen Proteine erwies sich die Aufreinigung als schwierig, da Präzipitatbildung und unvollständige Dimierisierung beobachtet wurden. Aus diesem Grund wurden FNIII10, TG-FNIII10, VEGFmut, TG-VEGFmut, FLV und TG-FLV in einem zweiten Ansatz in eukaryotischen Zellen (HEK293-EBNA) exprimiert. Die biologische Aktivität der aufgereinigten Proteine wurde in unterschiedlichen in vitro und in vivo Experimenten untersucht. In vitro Versuche an primären Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVECs) zeigten, dass TG-FNIII10 die Zelladhäsion konzentrationsabhängig fördert. Die Zelladhäsion konnte teilweise durch funktionsblockierende Antikörper gegen Integrin αvβ3 gehemmt werden. Desweiteren wurden VEGFmut und FLV über die Faktor XIIIa Substratsequenz kovalent im Fibringel gebunden und wurden auch nach zweitägigem Waschen im Gel zurückgehalten. Demgegenüber wurden die löslichen Proteine VEGFmut und FLV innerhalb von 8 Stunden vollständig aus dem Fibringel herausgewaschen. Ferner führte die Stimulation mit den rekombinanten VEGF-Proteinen in HUVECs zur Phosphorylierung von VEGFR-2, wie mittels Western Blot Untersuchungen und ELISA nachgewiesen wurde. Interessanterweise war die Phosphorylierung des Rezeptors nach Stimulation mit löslichem FLV im Vergleich zu VEGFmut reduziert, obwohl beide Proteine VEGFR-2 mit hoher Affinität binden, wie Oberflächenplasmon-Resonanzmessungen zeigten. Im Gegensatz dazu förderte auf Objektträgern immobilisiertes FLV die Zelladhäsion und -ausbreitung stärker als FNIII10 oder VEGFmut alleine. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass insbesondere die bifunktionalen Proteine in gebundener Form ein anderes Signalisierungspotential haben als in löslicher Form. In vivo Untersuchungen der rekombinanten Proteine in einem Model für gestörte Wundheilung an diabetischen Mäusen zeigten eine beschleuningte Wundheilung, wenn die Wunden mit Fibringelen, die 0.468 µM (entsprechend 20 µg/ml effektiver VEGF-Konzentration) VEGFmut, TG-VEGFmut oder TG-FLV enthielten, behandelt wurden. Wunden, die mit den kovalent an Fibrin gebundenen Proteinen TG-VEGFmut und TG-FLV behandelt wurden, zeigten an Tag 10 nach Wundsetzung eine deutlich erhöhte Angiogenese gegenüber Wunden, die mit löslichem VEGFmut in Fibrin oder nur mit Fibringel behandelt wurden. Darüberhinaus unterschieden sich zu diesem Zeitpunkt die Blutgefäße der mit TG-VEGFmut oder TG-FLV behandelten Wunden hinsichtlich ihrer Reife; die Rekrutierung von Perizyten in den mit TG-VEGFmut behandelten Wunden war deutlich weiter fortgeschritten. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine entscheidende Rolle für das Zusammenspiel von VEGF-A und der extrazellulären Matrix während der Wundangiogenese hin. Diese Ergebnisse könnten ferner als Grundlage neuer Ansätze für die Steuerung der Angiogenese auf molekularer Ebene und deren therapeutische Nutzung dienen.

German

Creators: