Universität zu Köln

Zielinski, Julia (2011). Analysis of fish-specific NLRs in zebrafish, Danio rerio. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

NLRs (NACHT domain and leucine-rich repeat containing proteins) comprise a family of intracellular pathogen recognition receptors that can activate the innate immune system, e.g. via inflammasomes or by activating the NFκB signalling pathway. The highly diverse family of nlr genes features a lineage-specific expansion in Danio rerio with at least 366 members. The predicted protein domain structure resembles the architecture of more intense studied mammalian NLRs as they all share a middle NACHT domain and leucine-rich repeats (LRRs) in their C-terminus. A structural hallmark of the fish NLRs is the fish-specific NACHT associated (Fisna) domain upstream of the NACHT domain which is why the proteins were called fish-specific NLRs. According to sequence similarities within the Fisna and NACHT domains they were subdivided into four groups. Since annotations of nlrs are not completed yet the numbers of nlr group members are only preliminary but based on current data nlr group III has the most members, followed by group II. nlr I and IV have similar few members. In this study data from different RT-PCRs and Northern blot experiments are presented that mainly confirmed the sizes of the four nlr groups. It also showed an expression of nlrs already at maternal stages that is maintained during embryonic and larval development. Moreover, it was shown that poly IC injection induced nlr I expression 3hpi. Similar results were observed for nlr III genes after the embryonic innate immune system was challenged with E. coli at 3hpi and 24hpi. Furthermore, in this study a group-specific interaction between NLRs has been demonstrated. A yeast two hybrid screen first revealed interaction between NLRs which was further specified and validated by yeast two hybrid experiments and co- IPs. All experiments consistently showed a strong protein binding between the Fisna and the NACHT domains in a group-specific way. To further narrow down the responsible recognition and binding sites domain swapping experiments were performed. Hybrid NACHT domains were generated that incorporated two different NLR groups. These were tested in comprehensive binding experiments that could restrict the binding side to the 78 aa of the N-terminal half of the NACHT domains.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language NLRs (NACHT domain and leucine-rich repeat containing proteins) bilden eine Familie von intrazellulären Rezeptoren, welche in die Zelle eingedrungende Pathogene erkennen und daraufhin das angeborene Immunsystem stimulieren. Dies geschieht zum Beispiel durch die Aktivierung und Bildung von Inflammasomen oder des NFκB Signalweges. Die nlr Genfamilie ist extrem divers und weist spezifisch für die Spezies Zebrafish eine phylogenetische Expansion von mindestens 366 Genen auf. Die vorausgesagte Proteinstruktur dieser neuen Familie ähnelt jener von den besser untersuchten Säugetier NLRs. Beide Gruppen weisen eine zentrale NACHT Domäne und sogenannte LRRs (leucine-rich repeats) in ihren C-terminalen Enden auf. Was NLRs in Fischen von denen in Säugern unterscheidet und gleichzeitig ein Kennzeichen für erstere bildet, ist die Fisna (fish-specific NACHT associated) Domäne. Diese Domäne ist der NACHT Domäne direkt vorgelagert. Anhand von Sequenzähnlichkeiten, die sowohl in der Fisna als auch der NACHT Domäne zu finden sind, lassen sich die Fisch NLRs in vier Gruppen unterteilen. Da die Annotationen der nlr Gene noch nicht vollständig abgeschlossen sind, wird die Anzahl der jeweiligen Gruppenmitglieder als vorläufig betrachtet. Basierend auf den aktuellen Daten lässt sich jedoch bereits festhalten, dass Gruppe III die meisten Mitglieder umfasst, gefolgt von Gruppe II, während Gruppen I und IV gleichermaßen die wenigsten Mitglieder aufweisen. In dieser Arbeit konnte durch RT-PCRs und Northern Blots diese Mengenverteilung auf die vier Gruppen größtenteils bestätigt werden. Darüber hinaus wurde mit Hilfe derselben Methoden, dass die Expression der nlrs bereits maternal vorhanden ist und sich über die Embryonalentwicklung und im Larvenstatium fortsetzt. Es konnte hier ebenfalls gezeigt werden, dass die Injektion von poly IC nach drei Stunden eine Erhöhung der nlr I Expression bewirkt. Auf ähnliche Weise reagiert die nlr III Untergruppe auf E. coli Bakterien. Drei bzw. 24 Stunden nachdem die Erreger injiziert wurden, konnte ein erhöhtes Level der nlr III Genexpression verzeichnet werden. Im weiteren Verlauf wurde eine gruppenspezifische Interaktion zwischen NLR Proteinen beobachtet. Zum ersten Mal wurde eine Bindung zwischen Fisch NLR Proteinen während eines Hefe Zwei Hybrid „Screens“ entdeckt, was in weiteren Hefe Zwei Hybrid Experimenten und Co-Immunoprezipitationen bestätigt werden konnte. Jedes dieser Experimente zeigte übereinstimmend die Interaktionen zwischen den ZUSAMMENFASSUNG 72 Fisna und NACHT Domänen, welche aus denselben NLR Gruppen stammten. Um die Sequenz, welche für Erkennung und Interaktion verantwortlich war, einzugrenzen, wurden hybride NACHT Konstrukte generiert. Diese hybriden NACHT Domänen vereinten zwei NLR Gruppen in sich. Die N-terminale Hälfte gehörte zu einer anderen NLR Untergruppe als der C-terminale Teil. Die hybriden NACHT Konstrukte wurden in umfassenden Interaktionsexperimenten eingesetzt, welche die Bindungsstelle auf die 78 Aminosäuren lange N-terminale Häfte der NACHT Domänen eingrenzen konnten. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zielinski, Julia julia_zielinski@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-46191
Date:	5 December 2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language zebrafish, innate immunity, NLRs, NACHT domain English Zebrafisch, angeborenes Immunsystem, NLRs, NACHT Domäne German
Date of oral exam:	30 January 2012
Referee:	Name Academic Title Leptin, Maria Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4619