New insights into the FLS2 trafficking and signaling pathway revealing a role for late defense responses in Arabidopsis immunity

Spallek, Thomas (2011). New insights into the FLS2 trafficking and signaling pathway revealing a role for late defense responses in Arabidopsis immunity. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Pathogen-associated molecular pattern (PAMP) triggered immunity (PTI) enables plants to efficiently defend themselves against most pathogens. PTI is initiated by plasma membrane pattern recognition receptors like Flagellin Sensitive 2 (FLS2), which detects flg22 peptides derived from bacterial flagellin. Flg22 triggers cellular trafficking of FLS2 to endosomal compartments and several defense responses, including early responses such as closure of stomatal apertures or gene activation and late responses such as seedling growth arrest or callose deposition. Cellular trafficking is often regulated by ubiquitination. In order to find factors modulating FLS2 endosomal trafficking, we used the Pseudomonas syringe pv. tomato (Pto) DC3000 effector AvrPtoB to identify residues in FLS2, which are ubiquitinated by AvrPtoB. Using tandem mass-spectrometry we identified one ubiquitination site in the juxtamembrane domain of FLS2. FLS2 mutated in all juxtamembrane located lysines showed reduced ubiquitination in vitro, enhanced resistance to Pto DC3000 and increased FLS2 endosome numbers upon flg22 treatment. Ubiquitinated plasma membrane proteins are targeted to late endosomal compartments by the Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) in yeast and animals. Using confocal microscopy we observed flg22-dependent co-localization of FLS2 with ESCRT-1 positive vesicles. Furthermore, ESCRT-1 mutants vps28-2 and vps37-1 showed reduced flg22-triggered defense gene activation, loss of flg22-dependent stomatal closure and decreased numbers of FLS2 endosomes. Both mutants showed higher susceptibility to biotrophic pathogens, indicating a role of ESCRT-1 components in plant immunity. A second approach aimed to genetically dissect flg22 responses by analyzing a previously isolated flagellin insensitive 1 (fli1) mutant. Fli1 mutants were similar susceptible to Pto DC3000 than fls2-17 receptor mutants. Increased susceptibility of fli1 to Pto DC3000 correlated with higher expression of sugar starvation responsive genes during infections and reduced late flg22 responses. Early flg22 responses and transcriptional profiles three hours post infection resembled wild-type plants, suggesting a positive role of late PAMP responses in plant immunity. Genetic analysis showed that fli1 is recessive inherited and co-segregated with markers on the upper arm of chromosome 5. Sequence differences in fli1 predicted by whole genome sequence analysis were, however, shared with Ler wild-type plants, leaving the designation of fli1 to one gene open. In conclusion, these data provide good evidences for a role of late FLS2 endosomal trafficking and late flg22-repsonses as critical components of plant immunity against Pto DC3000.

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Thesis (PhD thesis)

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Die Erkennung von Pathogenen wird über diverse Wirtsrezeptoren gewährleistet. Diese so genannten Mustererkennungsrezeptoren (engl. Pattern Recognition Receptors, PRR) erkennen pathogen-assoziierte molekulare Muster (engl. Pathogen Associated Molecular Pattern, PAMP). In Arabidopsis thaliana wird flg22, ein konservierter Bestandteil des bakteriellen Flagellums, von FLS2 (Flagellin Sensitive 2) Rezeptoren erkannt. Flg22 Perzeption führt zur Endozytose von FLS2 und zur Initiierung von früheren und späten PAMP Antworten. Frühe PAMP Antworten sind zum Beispiel die transkriptionelle Aktivierung von Genen und das Schließen von Stomataöffnungen. Späte Antworten dagegen beinhalten Kalloseablagerungen und die Reduktion des Keimlingswachstums. Endozytose und endosomaler Transport wird oft über Ubiquitinierung reguliert. FLS2 wird von endogenen Ubiquitinligasen und AvrPtoB, einem Effektorportein aus Pseudomonas syringae pv. tomato (Pto) DC3000, ubiquitiniert. Unsere Experimente zeigen, dass FLS2 an mindestens zwei unterschiedlichen Positionen von AvrPtoB in vitro ubiquitiniert wurde. Eine Position konnte dabei mittels Massenspektrometrie einem Lysin in der Juxtamembranregion von FLS2 zugeordnet werden. FLS2 Varianten, in denen mögliche Ubiquitinierungsstellen mutiert wurden, zeigten eine reduzierte Ubiquitinierung durch AvrPtoB in vitro, eine erhöhte Resistenz gegenüber Pto DC3000, sowie eine erhöhte Anzahl von FLS2 Endosomen im Vergleich zu untersuchten Wildtypkonstrukten. Studien in Hefe und tierischen Zellen zeigen, dass ubiquitinierte Plasmamembranproteine über den endosomalen Sortierung Komplex für Transport (ESCRT) zu spätendosomalen Kompartimenten transportiert werden. Mittels konfokaler Mikroskopie beobachteten wir, dass in transgenen Arabidopsis Pflanzen, FLS2 Endosomen mit ESCRT-1 Vesikeln partiell kolokalisieren. Darüberhinaus zeigten ESCRT-1 Mutanten vps28-2 und vps37-1 reduzierte flg22 induzierte Genaktivierung, Verlust von flg22 vermittelter Schließung der Stomataöffnungen, und eine geringere Anzahl an FLS2 Endosomen als Wildtyppflanzen. Beide Mutanten zeigten zudem eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber biotropher Pathogene, was auf eine Rolle von ESCRT-1 Proteinen in der Pflanzenimmunität hindeutet. In einer zweiten Studie, wurde die Rolle später flg22 Antworten genetisch untersucht. Dabei wurde eine zuvor isolierte flagellin insensitive 1 (fli1) Mutante genauer analysiert. Fli1 Mutanten zeigten eine ähnliche erhöhte Anfälligkeit gegenüber Pto DC3000 wie fls2-17 Rezeptormutanten. Transkriptionsanalysen zeigten, dass fli1 Mutanten besonders in späten Infektionsphasen deutlich anders als Wildtyppflanzen reagieren. So wurde einer erhöhten Expression von Gene gefunden, denen eine Rolle im Zuckermangel zugeschrieben wird. Auch andere späte Immunantworten waren in fli1 Mutanten deutlich verändert. Es wurden deutlich weniger flg22 induzierte Kalloseablagerungen und eine geringere flg22 Sensitivität in Keimlingswachstumsexperimenten gefunden. Frühe transkriptionelle Antworten dagegen glichen denen in Wildtyppflanzen. Auch in frühen PAMP Antworten unterschieden sich fli1 Mutanten nicht signifikant von Wildtyppflanzen. Zusammenfassend deuten unsere Daten daraufhin, dass späte PAMP Antworten eine wichtige Rolle in der pflanzlichen Immunität spielen. Genetische Analysen zeigten, dass fli1 rezessiv vererbt wird und mit Markern auf dem oberen Arm von Chromosom 5 kosegregiert. Sequenzunterschiede in fli1, ermittelt durch Genomsequenzierung, wurden jedoch auch in Wildtyppflanzen gefunden, so dass fli1 keinem Gen zu geordnet werden konnte.

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