ALP1 and ELP1 – novel genetic modifiers of LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 participate in Polycomb mediated gene repression in Arabidopsis

Hartwig, Benjamin (2012). ALP1 and ELP1 – novel genetic modifiers of LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 participate in Polycomb mediated gene repression in Arabidopsis. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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ALP1 and ELP1 – novel genetic modifiers of LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 participate in Polycomb mediated gene repression in Arabidopsis. (deposited 23 Jan 2013 14:08) [Currently Displayed]

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Abstract

Polycomb Group (PcG) proteins are involved in the inheritance of phenotypic traits by repressing the expression of target genes through binding of chromatin. In Arabidopsis thaliana several Polycomb Repressive Complexes (PRCs) are active during different stages of development. Distinct components of PRCs2, such as CURLY LEAF, SWINGER and MEDEA, contain a SET-domain for the trimethylation of lysine 27 at histone 3. This trimethylationmark is bound by PRC1 which leads to stable repression of the corresponding euchromatic locus. LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) is a plant PRC1 component and an orthologue of HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (HP1) of humans, flies and yeast. Two of the PcG proteins that bind LHP1 catalyze mono-ubiquitylation of histone 2A but do not display homology to PRC1 PcG proteins in other organisms. The aim of this study is the identification of enhancers and suppressors of the lhp1 mutant phenotype to unravel PRC1 characteristics and functions in plants. Double mutants were generated with lhp1 seeds in the Col-0 background through application of EMS and selected by phenotype and quantitative real-time PCR of known PRC1 target genes. Next-generation-sequencing of backcrossed, isogenic, bulked DNA samples of candidates was conducted. This isogenic mapping-by-sequencing approach revealed causal amino acid changes for two suppressors and three enhancers of LHP1. One enhancer candidate encodes a WD 40 domain protein predicted to function as an interaction hub preferentially for nuclear proteins. A suppressor gene product has similarities to Harbinger transposases and likely contains a functional DNA-binding domain. De-regulated genes in those double mutants were analyzed via mRNA-seq, to link candidate genes to a possible function in chromatin regulation. In the suppressor the majority of de-regulated genes in lhp1 were again expressed at wild-type (WT) levels. Some genes in the enhancer were de-regulated to a greater extend, than in lhp1. MADS box transcription factors were up-regulated in lhp1 compared to WT. The up-regulation of those genes was moderated in the suppressor and higher in the enhancer. Consequently the suppressor and the enhancer were named ANTAGONIST OF LHP1 1 (ALP1) and ENHANCER OF LHP1 1 (ELP1) respectively. ALP1 and ELP1 are nuclear proteins that both interacted with LHP1 in split-YFP assays. Further, ELP1 interacted with INCURVATA 2 (ICU2), a subunit of DNA-polymerase alpha that is binding LHP1 in vitro. ALP1 and ELP1 present a possible link to epigenetic regulation. ALP1 could be a direct repressor of LHP1, while ELP1 might be part of PRC1.

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Thesis (PhD thesis)

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ALP1 und ELP1 - neue genetische Modifikatoren von LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 nehmen an durch Polycomb vermittelter Genrepression in Arabidopsis teil	German

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Abstract

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Polycomb Group (PcGs) Proteine nehmen auf die Vererbung phänotypischer Merkmale Einfluss, indem sie Chromatin binden und somit Zielgene reprimieren. In Arabidopsis thaliana sind mehrere Polycomb Repressive Komplexe (PRCs) in unterschiedlichen Entwicklungsphasen aktiv. Einzelne Komponenten von PRCs2, wie CURLY LEAF, SWINGER und MEDEA, beinhalten eine SET-Domäne, mittels derer sie Lysin 27 von Histon 3 tri-methylieren. Diese Histonmarkierung wird von PRC1 gebunden, wodurch entsprechende, euchromatische Loci stabil reprimiert werden. LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) ist Teil von PRC1 in Pflanzen und ein Ortholog von HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (HP1) aus Menschen, Fliegen und Hefe. Zwei LHP1 bindende PcG Proteine katalysieren die Monoubiquitinierung von Histon 2A, zeigen jedoch keine Homologie zu PRC1 PcG Proteinen anderer Organismen. Das Ziel dieser Studie war die Indentifizierung von Verstärkern (Enhancer) und Unterdrückern (Suppressoren) des lhp1 Mutantenphänotyps, um die Charakteristika und Funtionen von PRC1 in Pflanzen zu entschlüsseln. Doppelmutanten wurden mit lhp1 Samen im Col-0 Hintergrund durch die Anwendung von EMS generiert und phänotypisch, sowie durch quantitative Echtzeit-PCR bekannter PRC1 Zielgene selektiert. Isogene Mischproben der DNA von Kandidaten des Screens wurden mit Sequenziern der neuen Generation sequenziert. Diese isogene Katrierung durch Sequenzierungsanwendung enthüllte kausale Aminosäureänderungen für zwei Suppressoren und drei Enhancer von LHP1. Ein Enhancerkandidat kodiert für ein Protein mit einer WD 40 Domäne, welches als ein Protein mit vielen Interaktionen, preferentiell mit nuklearen Proteinen, prognostiziert wird. Ein Genprodukt eines Suppressors zeigt Ähnlichkeiten zu Harbinger Transposasen und enthält wohlmöglich eine funktionelle DNA-Bindedomäne. Deregulierte Gene in diesen beiden Doppelmutanten wurden durch mRNA-Sequenzierung analysiert, um die Zielgene mit einer möglichen Funktion in der Regulation von Chromatin zu verbinden. Im Suppressor waren die Mehrheit der in lhp1 de-regulierten Gene wieder auf Wildtyp (WT) Niveau exprimiert. Einige Gene des Enhancers waren in höherem Maße de-reguliert als in lhp1. MADS-box Transkriptionsfaktoren in lhp1 waren hochreguliert im Vergleich zum WT. Die Hochregulation dieser Gene war abgeschwächt im Suppressor und erhöht im Enhancer. Aus diesem Grund wurden der Suppressor ANTAGONIST OF LHP1 1 (ALP1) und der Enhancer ENHANCER OF LHP1 1 (ELP1) genannt. ALP1 und ELP1 sind nukleare Proteine, die beide mit LHP1 in gespaltenem YFP Untersuchungen interagierten. Weiterhin interagierte ELP1 mit INCURVATA 2 (ICU2), einer Untereinheit der DNA Polymerase Alpha, welche LHP1 in vitro bindet. ALP1 und ELP1 zeigen eine mögliche Verbindung zu epigenetischer Regulation. ALP1 könnte als direkter Repressor von LHP1 fungieren, während ELP1 eventuell Teil eines PRC1 ist.

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