Universität zu Köln

Küster, Christian (2012). Population genetics, ecogenomics and physiological mechanisms of adaptation of Daphnia to cyanobacteria. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

In many freshwater ecosystems Daphnia represent both, an important herbivorous grazer of phytoplankton and a major prey of planktivorous fish and invertebrate predators. Thus, Daphnia provide an important link for the transfer of energy and carbon from primary producers to higher trophic levels. In eutrophic lakes this transfer is often reduced by the occurrence of cyanobacteria that are known for their low food quality for Daphnia: Cyanobacteria lack essential sterols and polyunsaturated fatty acids, are often filamentous or colonial and contain even toxins like microcystins and protease inhibitors. Although Daphnia populations are able to adapt to the presence of cyanobacteria, little is known about the physiological mechanisms and the particular genes and metabolic pathways underlying this adaptation. The present study considers various intra- and interspecific aspects of Daphnia’s tolerance to cyanobacteria. Besides classical ecological approaches, such as growth and competition experiments, the focus of the present dissertation was the analysis of specific target genes of Daphnia that were related to the response to secondary metabolites of cyanobacteria, such as protease inhibitors and microcystins. I found here for the first time evidence that cyanobacterial inhibitors, interfering with Daphnia’s major gut proteases (chymotrypsin and trypsin), occurred in the edible fraction of natural lake seston and varied significantly within season. In parallel with seasonal changes in the potential of the phytoplankton to inhibit proteases, the genetic structure of the co-occurring D. magna population changed significantly, which might result from natural selection due to the increased content of cyanobacterial protease inhibitors in the seston. Depending on initial conditions Daphnia may also control the development of bloom-forming cyanobacteria with protease inhibitors and may even suppress already established cyanobacterial blooms. In life-table experiments with cyanobacteria containing inhibitors of chymotrypsin and trypsin I investigated the tolerance of various clones of D. magna and D. pulex with different geographic origins. I showed that D. magna is more tolerant to cyanobacteria with protease inhibitors and thus may control the development of cyanobacterial blooms more efficiently than D. pulex. Protease assays revealed that the sensitivities of chymotrypsins and trypsins to cyanobacterial inhibitors did not differ between D. magna and D. pulex. However, D. magna exhibited a more than two times higher specific chymotrypsin activity than D. pulex, which explains the observed higher tolerance to cyanobacterial protease inhibitors of D. magna. The higher tolerance of D. magna to cyanobacterial protease inhibitors compared to that of D. pulex might result from differences in their coexistence with cyanobacteria. Adaptation of Daphnia populations to environmental stressors is typically a result of microevolutionary processes leading to natural selection. Determining genetic variation at the DNA level within and between natural Daphnia population is important for understanding the role of natural selection on phenotypic traits. In the present study I demonstrate that high-resolution melting analysis (HRMA) is a cost effective and sensitive tool for screening variable target genes in natural Daphnia populations. HRMA is based on monitoring the melting of PCR-amplicons and has usually been applied in clinical studies and medical molecular diagnostics. As a proof of principle for the application of HRMA in Daphnia population genetics I have analyzed the genetic variability of digestive trypsins in two D. magna populations. Both populations differed in their experience with respect to cyanobacterial trypsin inhibitors. I hypothesized that D. magna clones from ponds with cyanobacteria have undergone selection by these inhibitors, which has led to different trypsin alleles. My results revealed that both populations exhibited phenotypic difference in the analyzed trypsins and that HRMA is a powerful genotyping tool for screening high numbers of individuals in population studies. The last part of my thesis considers anthropogenic long-term effects on D. galeata in Lake Constance, which underwent periods of eutrophication and re-oligotrophication in the last century. In order to investigate the influence of changing selection factors in Lake Constance on the genomic structure of the D. galeata population, I have isolated and pooled D. galeata resting eggs from four different layers of sediment cores, representing the time periods before, during and after the peak of the eutrophication. The extracted genomic population DNA samples from the different time periods were sequenced with a mean coverage of 50x via next-generation sequencing. After mapping the total reads of each population on predicted genes of D. galeata, I performed a genome-wide assessment of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and copy number variations of several gene families in each of the three D. galeata populations. The data were used to determine the genetic diversity of the D. galeata populations and to indentify particular target gene families and metabolic pathways that were influenced by the environmental changes mentioned above. The data suggest that cyanobacterial protease inhibitors and oxidative stress induced by microcystins from cyanobacteria were the selective forces contributing to the genotypic shift towards a more cyanobacteria-tolerant D. galeata population during the time of eutrophication.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language In vielen Seen sind Daphnien als unselektive Filtrierer einer der Hauptkonsumenten von pelagischen Phytoplanktern und dienen des Weiteren als Nahrungsquelle von planktivoren Fischen und invertebraten Räubern. Dadurch nehmen Daphnien eine Schlüsselstellung im Transfer von Energie und Kohlenstoff von Primärproduzenten zu höheren trophischen Ebenen ein. Dieser Transfer ist in eutrophen Gewässern häufig durch die Anwesenheit von Cyanobakterien gestört, da diese ein Futter von geringer Qualität für Daphnien darstellen. Cyanobakterien besitzen die Fähigkeit, Kolonien oder Filamente zu bilden, womit sie ab einer gewissen Größe nicht mehr von Daphnien ingestiert werden können. Des Weiteren fehlen Cyanobakterien Sterole und ausreichende Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Darüber hinaus können Cyanobakterien für Daphnien toxische Sekundärmetabolite, wie zum Beispiel Proteaseinhibitoren oder Microcystine, enthalten. Daphnienpopulationen sind in der Lage sich an die Anwesenheit von Cyanobakterien anzupassen; allerdings sind sowohl die physiologischen Mechanismen, die dieser Anpassung zugrunde liegen, als auch die verantwortlichen Gene und Stoffwechselwege bisher nur wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene intra- und interspezifische Aspekte untersucht, die sich mit der Anpassung von Daphnien an Cyanobakterien beschäftigen. Neben klassischen Wachstums- und Konkurrenzversuchen liegt ein Schwerpunkt dieser Arbeit in der Identifizierung und Analyse spezieller Zielgene aus Daphnien, von denen vermutet wird, dass toxische Sekundärmetabolite aus Cyanobakterien einen Selektiondruck auf diese Gene ausüben können. Zu diesen toxischen Sekundärmetaboliten gehören neben hepatotoxisch wirkenden Microcystinen auch cyanobakterielle Inhibitoren von Trypsinen und Chymotrypsinen. Diese beiden Proteasen sind zusammen für mehr als 80% der proteolytischen Aktivität im Darm von Daphnien verantwortlich. In Kapitel 1 konnte ich zeigen, dass das die für Daphnien freßbare Größenfraktion des Sestons eines natürlichen Gewässers Trypsine und Chymotrypsine inhibiert, und dass die Stärke der Inhibition starken saisonalen Schwankungen unterliegt. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass sich parallel mit den jahreszeitlichen Schwankungen des Inhibitionsvermögens des Sestons auch die genetische Struktur der coexistierende D. magna Population signifikant veränderte, was eine Folge von natürlicher Selektion sein könnte. Je nach Ausgangsbedingungen sind Daphnien in der Lage, die Entstehung cyanobakterieller Massenentwicklungen zu unterdrücken. In Wachstumsversuchen mit Cyanobakterien, die Inhibitoren gegenüber Trypsinen und Chymotrypsinen enthielten, habe ich die Toleranz verschiedener D. magna und D. pulex Klone aus unterschiedlichen Ursprungshabitaten untersucht. Ich konnte zeigen, dass D. magna eine höhere Toleranz gegenüber Cyanobakterien aufweist als D. pulex. Dies lässt die Vermutung zu, dass D. magna die Entstehung von Cyanobakterienblüten effizienter kontrollieren kann als D. pulex. Enzymatische Untersuchungen ergaben, dass sich weder Chymotrypsine noch Trypsine aus D. magna und D. pulex hinsichtlich ihrer Sensitivitäten gegenüber cyanobakteriellen Inhibitoren unterschieden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass D. magna eine doppelt so hohe spezifische Chymotrypsinaktivität besitzt als D. pulex. Dies könnte ein Grund für die beobachtete höhere Toleranz gegenüber Cyanobakterien von D. magna im Vergleich zu D. pulex sein. Eine Anpassung von Daphnienpopulation an veränderte Umweltbedingungen ist häufig eine Konsequenz von natürlicher Selektion aufgrund von Mikroevolution. Die genaue Bestimmung genetischer Variabilität innerhalb und zwischen Daphnienpopulation ist von entscheidender Bedeutung, um natürliche Selektion und deren Auswirkung auf phäntoypische Merkmale besser verstehen zu können. In der vorliegenden Arbeit wird die Methode der hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (high-resolution melting analysis, HRMA) als günstige und sensitive Alternative zu herkömmlichen Sequenzierungsmethoden genutzt, um genetische Variabiltät von Zielgenen effektiv analysieren zu können. HRMA basiert auf der exakten Analyse des Schmelzverhaltens kompletter PCR Produkte und wird vornehmlich in klinischen Studien sowie in der molekularen Diagnostik verwendet. Als Anwendungsbeispiel der HRMA wurde die genetische Variabilität verschiedener Trypsingene aus zwei D. magna Populationen untersucht. Eine der beiden Populationen stammte aus einem Gewässer ohne Cyanobakterien, während die andere Population aus einem Gewässer mit jährlich auftretenden Cyanobakterienblüten entstammt. Die Hypothese war, dass D. magna Klone aus cyanobakterienreichen Gewässern aufgrund von natürlicher Selektion durch Proteaseinhibitoren andere Trypsinallele aufweisen als Klone aus cyanobakterienfreien Gewässern. Die Ergebnisse ergaben Unterschiede in der Aminosäuresequenz der analysierten Trypsinen zwischen beiden D. magna Population. Im Allgemeinen konnte ich zeigen, dass sich die Methode der hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse ideal zur Genotypisierung einer großen Anzahl von Individuen in Populationsanalysen eignet. Der letzte Abschnitt meiner Dissertation behandelt den Einfluss anthropogener Langzeiteffekte auf die im Bodensee existierende D. galeata Population. Durch erhöhten Phosphoreintrag und nachfolgend eingeleitete Sanierungsmaßnahmen durchlief der Bodensee eine Phase der Eutrophierung und anschließenden Re-Oligotrophierung in der zweiten Häfte des letzen Jahrhunderts. Um die Einflüsse dieser schwankenden Umweltbedingungen auf die genetische Struktur der D. galeata Population zu analysieren, wurden aus verschiedenen Schichten mehrerer Bohrkerne aus dem Sediment des Bodensees Dauereier von D. galeata isoliert. Die Schichten, aus denen die Dauereier separat isoliert wurden, entsprachen der Zeit vor, während und nach dem Höhepunkt der Eutrophierung des Bodensees. Anschließend wurde die DNA aus jeder Population separat extrahiert, mittels ‚Next-Generation Sequencing‘ analysiert und anschließend mit vorhandenen Transkriptomdaten von D. galeata abgeglichen. Dies ermöglichte es mir einen genomweiten Vergleich einzelner Nukleotidpolymorphismen (SNPs) sowie Unterschiede in der Anzahl der Kopien bestimmter Zielgene zwischen den einzelnen Populationen zu untersuchen. Die so gewonnen Daten dienten zum einen dazu, die genetische Diversität der D. galeata Population vor, während und nach der Eutrophierung zu messen. Des Weiteren sollten Zielgene und Stoffwechselwege identifiziert werden, die sich möglichweise durch sich wechselnden Umweltbedingungen des Bodensees in der D. galeata Population verändert haben. Die Analyse der Daten stützt die Vermutung, dass ein Anstieg von Proteaseinhibitoren sowie oxidativer Stress durch Mikrocystine, bedingt durch das im Zuge der Eutrophierung vermehrte Auftreten von Cyanobakterien, wichtige Selektionfaktoren darstellten, die zu den gefundenen genetischen Veränderungen der D. galeata Populationen beigetragen haben. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Küster, Christian meroder@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-50211
Date:	21 November 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Cyanobacteria, Daphnia, microevolution, protease inhibitors, population genetics, ecogenomics, physiological mechanisms English
Date of oral exam:	18 January 2013
Referee:	Name Academic Title von Elert, Eric Prof. Dr. Arndt, Hartmut Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5021