Universität zu Köln

Frankó, András (2007). The role of AMPK and CREB-1 in the regulation of mitochondrial biogenesis during muscle differentiation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The aim of the study was to identify main regulators of mitochondrial biogenesis in a skeletal muscle differentiation model. To investigate candidate factors we used the cytochrome c promoter as a representative promoter since cytochrome c levels correlate well with respiratory chain complexes. We chose the AMP activated kinase (AMPK) and cyclic AMP-response element binding protein 1 (CREB-1) as promising candidates, which could control the process of mitochondrial proliferation. To analyze whether AMPK regulates the cytochrome c promoter, a cell line stably expressing a constitutively active AMPKalpha1-CA was generated. Indeed, AMPKalpha1-CA kinase activity was found to be increased in these clones. However, AMPKalpha1-CA and dominant negative AMPKalpha constructs did not change cytochrome c promoter activity in reporter gene assays, total AMPK activity was unchanged during muscle differentiation suggesting that it is not involved in the regulation of mitochondrial biogenesis in this model. In contrast, the constitutively active CREB construct, C2/CREB, elevated cytochrome c promoter activity. This increased promoter activity was diminished in the presence of a dominant negative CREB (A-CREB) construct showing that CREB-1 directly activates the cytochrome c promoter. Western blot analysis revealed two different CREB-1 isoforms: CREB-1alpha and CREB-1delta. Myoblasts contain predominantly CREB-1delta, while myotubes have preferably the CREB-1alpha isoform. The phosphorylation state of these isoforms changed in parallel with their protein levels suggesting a functional isoform switch during differentiation. Two appropriate, alternatively spliced isoforms of CREB-1 mRNA were found but their ratio did not change during differentiation. This suggests that posttranslational modifications and/or recruitment of the CREB-1 isoforms by other factors of the transcriptional complex play a dominant role in determining their cellular levels. To elucidate, which upstream factors regulate the activity of CREB-1, kinase and phosphatase inhibitors were used. A PKA activator and two phosphatase inhibitors increased the phosphorylation of CREB-1 at Ser-133, which is thought to be necessary for its activation. Furthermore, Cyclosporin A not only enhanced phosphorylation of CREB-1, but also the cytochrome c promoter activity. Therefore, it is likely that PP2B (calcineurin) regulates the phosphorylation of CREB-1 during muscle differentiation. Intracellular resting calcium levels were found to be smaller in myotubes compared to myoblasts, thus changes in steady-state calcium levels seem not to be a key regulator of mitochondrial biogenesis in muscle cells. In summary, these data indicate that phosphorylation and an isoform switch of CREB-1 could play a major role in the regulation of cytochrome c promoter and thus mitochondrial biogenesis during muscle differentiation.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Die Rolle von AMPK und CREB-1 in der Regulation der mitochondrialen Biogenese während der Muskeldifferenzierung UNSPECIFIED
Translated abstract:	Abstract Language Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, wichtige Regulatoren der mitochondrialen Biogenese in einem Skelettmuskel-Differenzierungsmodell zu identifizieren. Zur Untersuchung relevanter Faktoren wurde repräsentativ der Cytochrom c-Promotor verwendet, da der Cytochrom c-Gehalt mit dem Gehalt der Atmungskettenkomplexe korreliert. Das Enzym AMPK (AMP activated kinase) und CREB-1 (cyclic AMP-response element binding protein 1) wurden als vielversprechende Kandidaten bei der Regulation der mitochondrialen Proliferation ausgewählt. Zur Untersuchung des regulatorischen Einflusses von AMPK auf den Cytochrom c-Promotor wurde eine Zelllinie generiert, die stabil eine konstitutiv aktive AMPKalpha1-CA exprimiert. Tatsächlich zeigten diese Klone eine erhöhte konstitutiv aktive Kinase-Aktivität. In Reporter-Genassays wurde dennoch keine durch AMPKalpha1-CA oder dominant negativen AMPKalpha-Konstrukts veränderte Cytochrom c-Promotor-Aktivität beobachtet, die gesamte Kinase-Aktivität ist während der Differenzierung unverändert geblieben, was darauf hindeutet, dass AMPKalpha1 nicht an der Regulation der mitochondrialen Biogenese in diesem Modell beteiligt ist. Im Gegensatz dazu erhöhte der konstitutiv aktive CREB-Konstrukt, C2/CREB, die Cytochrom c-Promotor-Aktivität. Diese erhöhte Promotor-Aktivität wurde in Gegenwart eines dominant negativen CREB-Konstrukts (A-CREB) vermindert und weist damit auf eine direkte Aktivierung des Cytochrom c Promotors durch CREB-1 hin. Zwei unterschiedliche CREB-Isoformen konnten mittels Western Blot-Analysen gefunden werden: CREB-1alpha und CREB-1delta. Myoblasten enthalten vorrangig CREB-1delta, während Myotuben hauptsächlich die CREB-1alpha Isoform exprimieren. Der Phosphorylierungsstatus der beiden Isoformen veränderte sich entsprechend ihrer Proteinexpression. Dies deutet auf einen funktionellen Wechsel der Isoformen im Zuge der Differenzierung hin. Zwei entsprechende, alternativ gespleißte Isoformen der CREB mRNA werden nachgewiesen, deren Verhältnis sich jedoch während des Differenzierungsprozesses zueinander nicht änderte. Dies lässt vermuten, dass posttranslationale Modifikationen und/oder die Rekrutierung der CREB-1 Isoformen durch andere Faktoren des Transkriptionsapparates eine große Rolle bei der Regulation ihres zellulären Gehalts einnehmen. Um aufzuklären, welche vorgeschalteten Faktoren die Aktivität von CREB-1 aktivieren, wurden Kinase- und Phosphatase-Inhibitoren eingesetzt. Die Phosphorylierung von CREB-1 an der Position Ser-133, die für dessen Aktivierung wichtig ist, wurde durch einen PKA-Aktivator und zwei Phosphatase-Inhibitoren erhöht. Des Weiteren steigerte Cyclosporin A nicht nur die Phosphorylierung von CREB-1, sondern auch die Cytochrom c Promotor-Aktivität. Daher ist es wahrscheinlich, dass PP2B (Calcineurin) die Phosphorylierung von CREB-1 während der Muskeldifferenzierung reguliert. In Vergleich zu Myoblasten waren aber die basalen intrazellulären Kalziumlevels bei Myotuben geringer. Demnach scheinen Veränderungen des basalen Kalziumlevels in Muskelzellen keine Schlüsselfunktion während der mitochondrialen Biogenese zu haben. Zusammengefasst weisen diese Daten darauf hin, dass die Phosphorylierung und der Wechsel zwischen den CREB-1 Isoformen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Cytochrom c-Promotors und somit der mitochondrialen Biogenese bei der Muskeldifferenzierung einnehmen können. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Frankó, András UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-53717
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Physiologie und Pathophysiologie > Institut für Vegetative Physiologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Mitochondria , Muskel , CREB , AMPK German mitochondria , muscle , CREB , AMPK English
Date of oral exam:	10 July 2007
Referee:	Name Academic Title Wiesner, Rudolf J. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5371