Universität zu Köln

Giriyapura, Bharath Nijaguna (2021). Role of GPCR methuselah and methuselah-like genes in ageing and stemness in Drosophila. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Dietary restriction extends lifespan in diverse species. Aside from that inhibition of reproduction is one of the most effective ways to extend animal lifespan. The genetic or surgical ablation of the reproductive system significantly extends lifespan in many animals. In most cases, targeted ablation of germline stem cells significantly extends, and overproliferation shortens the lifespan. However, in some cases ablation of the entire somatic gonad abrogated lifespan extension caused by other factors. Thus, the balance between longevity assurance signals from the somatic gonad and germline affects ageing. At the same time, many interventions with an impact on longevity also affect GSC cell cycle progression in nematodes and fruit flies. Mth is a GPCR associated with longevity. mth1 flies carrying a P-element insertion in the mth locus display lifespan expansion of up to 35%. These animals are resistant to different forms of stress including starvation, temperature and oxidative stress. Nutritional coupling of Mth and its ligand Stunted (Sun) is involved in development and experiments using small-molecule ligands revealed that Mth regulates longevity via the dTOR pathway. In addition, mth1 mutant flies show persistent germline stem cell function with age. However, the molecular relationship between ageing and stem cell maintenance has not been fully unravelled. In this study, I investigated the role of mth and mthl genes in aging and stem cell maintenance. At first, I asked whether ablation of germ cells affects the lifespan of long-lived mth1 mutant animals. These experiments revealed that the complete absence of the germline by mutation of germ cell less (gcl) reduced the lifespan of mth1 mutant animals, whereas killing of adult germ cells in ovaries of mth1 mutant animals by germ line-specific overexpression of Bam increased the lifespan. Overproliferation of GSC-like cells in bam86 ovaries caused lifespan reduction in the mth1 mutant, as did modulation of GSC-like cell overproliferation by UAS-Gal4-mediated bam knockdown in adult female flies. Together, these findings reveal that the effects of germline manipulation and mth-dependent signaling with respect to longevity are additive and thus independent of each other. Previously, studies to uncover stemness factors in GSCs using next-generation sequencing were conducted in our lab. It was found that several mthl genes were differentially expressed in bam86 ovaries, among them mthl7 and mthl8. I have analysed the role of mthl genes in ageing and stem cell maintenance in Drosophila. First, I looked at the expression pattern of mthl genes using modENCODE and other database resources. Interestingly, mthl7 and mthl8 genes were not expressed in ovaries. I tested by fluorescent in situ hybridization whether transcripts of mthl7 and mthl8 were upregulated in bam86 ovaries but that was not the case. Furthermore, germline-specific and somatic knockdown of mthl genes did not impair GSC maintenance, but reduced the lifespan of female flies. Rescue experiments revealed that knockdown of mthl7 and mthl8 in bam86 ovaries did not modify the bam mutant phenotype. Altogether our results indicate that mthl genes are neither involved in GSC maintenance nor in longevity signaling pathways.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Reduzierte Kalorienzufuhr verlängert die Lebenserwartung in zahlreichen Tierarten. Ebenso führt die Verhinderung der Reproduktion durch genetische oder operative Entfernung der Fortpflanzungsorgane in vielen Spezies zur signifikanten Verlängerung der Lebenserwartung. In vielen Fällen geht die gezielte Entfernung der Keimbahnstammzellen mit einer signifikanten Verlängerung der Lebenserwartung einher, während deren Überproliferation die Lebenserwartung verkürzt. Allerdings wurde in einigen Fällen beobachtet, dass die vollständige Entfernung der somatischen Gonaden die lebensverlängernden Effekte anderer Interventionen zunichte machte. Daraus wurde geschlussfolgert, dass die Balance zwischen lebensverlängernden Effekten der somatischen Gonaden und der Keimbahnstammzellen ausschlaggebend für die tatsächliche Lebenserwartung ist. Andererseits wurde in Fadenwürmern und Fruchtfliegen gezeigt, dass Interventionen, die die Lebenserwartung verändern, auch Effekte auf Proliferation und Zellzyklusregulation von Keimbahnstammzellen mit sich bringen. Methuselah (Mth) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der die Lebenserwartung beeinflusst. Die durch Insertion eines Transposons induzierte Mutation mth1 in Drosophila führt zu einer Verlängerung der Lebenserwartung um 35%. Diese Tiere zeigen außerdem eine erhöhte Resistenz gegenüber verschiedenen Arten von Stress, z. B. Nahrungsentzug, Temperatur und oxidativem Stress. Der Signalweg des Mth-Rezeptors wird durch Bindung des Liganden Stunted (Sun) in Abhängigkeit vom Ernährungszustand aktiviert und reguliert u. a. die Entwicklung. Experimente mit niedermolekularen Liganden zeigten, dass Mth die Lebenserwartung über den dTOR Signalweg beeinflusst. Interessant ist auch, dass in mth1 mutanten Fliegen die Teilungsaktivität von Keimbahnstammzellen auch im Alter nicht abnimmt. Allerdings sind die Zusammenhänge zwischen dem Alterungsprozess und dem Erhalt der Stammzellaktivität noch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit habe ich die Funktion von mth und mth-like (mthl) Genen im Alterungsprozess und für den Erhalt der Stammzellaktivität untersucht. Zunächst untersuchte ich, ob die Ablation der Keimbahn die Lebenserwartung von mth1 mutanten Fliegen beeinflusst. Diese Experimente erbrachten das Ergebnis, dass eine vollständige Ablation der Keimbahn schon zu Beginn der Embryonalentwicklung die Lebenserwartung von mth1 mutanten Fliegen verkürzte, während die Ablation der Keimbahn im Larvenstadium durch Überexpression des Differenzierungsfaktors Bam die Lebenserwartung deutlich erhöhte. Im Gegensatz dazu reduzierte sich die Lebenserwartung, wenn stammzellartige Keimbahnzellen durch Mutation oder knockdown von bam zur Überproliferation gebracht wurden, sowohl im Larvenstadium als auch in adulten Tieren. Zusammengefasst zeigten diese Daten, dass die Effekte der Keimbahnmanipulation und der Mutation von mth auf die Lebenserwartung additiv und damit weitgehend unabhängig voneinander sind. In einer bereits publizierten Arbeit aus unserer Arbeitsgruppe wurde mithilfe von next generation RNA Sequenzierung nach Faktoren gesucht, die für den Erhalt der Stammzelleigenschaften von Keimbahnstammzellen verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass mehrere mthl Gene, darunter mthl7 und mthl8, im Vergleich von Kontrollen mit bam86 mutanten Ovarien differentiell in der Keimbahn exprimiert werden. Ich habe die Funktion dieser Gene im Alterungsprozess und für den Erhalt der Keimbahnstammzellen untersucht. Zunächst analysierte ich die Expression dieser Gene mithilfe von modENCODE und anderen Datenbanken. Dabei stellte sich heraus, dass mthl7 und mthl8 in wildtypischen Ovarien nicht exprimiert werden. Auch in bam86 mutanten Ovarien konnte ich durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung keine Expression nachweisen. Sowohl keimbahnspezifischer als auch somatischer knockdown der untersuchten mthl Gene hatte keinerlei Effekte auf den Erhalt der Stammzellen, verkürzte aber deutlich die Lebenserwartung der Tiere. Rettungsexperimente zeigten keinen Effekt des knockdowns von mthl7 und mthl8 auf den bam86 mutanten Phänotyp. Zusammenfassend komme ich zu der Schlussfolgerung, dass die von mir untersuchten mthl Gene keine mit mth vergleichbare Funktion für den Erhalt von Stammzellen oder die Beeinflussung der Lebenserwartung ausüben. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Giriyapura, Bharath Nijaguna bharathgnbavimane@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-538375
Date:	2021
Place of Publication:	Cologne
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Anatomie > Institut I für Anatomie
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language ageing, germline stem cells, Methuselah, methuselah-like, UNSPECIFIED
Date of oral exam:	21 July 2021
Referee:	Name Academic Title Wodarz, Andreas Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Roth, Siegfried Univ.-Prof. Dr. rer. nat.
Funders:	CECAD
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/53837