Universität zu Köln

Harmel, Julia (2014). Posttranscriptional regulation of mitochondrial DNA in mammalian mitochondria. PhD thesis, Max-Planck Institut für Biologie des Alterns.

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Abstract

Mitochondria are the most important organelles for ATP supply in nearly all eukaryotic cells. Besides energy production, mitochondria also play important roles e.g. in calcium homeostasis, apoptosis or fatty acid ß-oxidation. They originated from a proto-bacterium and therefore contain their own genome encoding for a subset of mitochondrial OXPHOS components as well as tRNAs and rRNAs necessary for the translation machinery. Regulation of mtDNA expression is indispensable for normal OXPHOS function and defective mitochondrial function can cause neurodegenerative diseases but is also linked to aging, cancer and diabetes. Mitochondrial transcription factor 1 (MTERF1) has been reported to regulate H-strand transcription of the two ribosomal RNA genes through simultaneous binding of the heavy strand promoter and its termination site based on extensive in vitro studies during the last decades. However, evidence for its function in vivo is still missing. In this work, analysis of the first Mterf1 knockout mouse model reveals that lack of MTERF1 has no effect on ribosomal RNA levels, but instead causes increased RNA levels on the antisense region of mitochondrial rRNAs. At the same time transcription initiation events are decreased at the light-strand promoter suggesting that MTERF1 has a role in transcription termination on the L-strand to prevent transcriptional interference at the light-strand promoter. Studies in mice lacking the mitochondrial transcription termination factor 2 (MTERF2) show apparently healthy and fertile animals with normal lifespan. However, mice challenged with a ketogenic diet have been reported to develop a muscle-specific phenotype including decreased transcription and OXPHOS deficiency. A second Mterf2 knockout mouse model, created in our lab, however, does not confirm the reported phenotype. The viral trap, a genetic tool used to interrupt Mterf2 gene expression in one of the mouse models, could explain the observed differences since it contains a very strong promoter, which can influence the expression of other genes closely located to the target gene. A gene encoding cryptochrome 1 (CRY1) is situated 1,6 kb downstream of Mterf2 and could be influenced by a viral trap targeting the Mterf2 gene. In order to test this hypothesis, we simultaneously analyzed the two Mterf2 knockout mouse models, a Cry1 knockout mouse and controls and found that all mice were healthy and fertile with a normal lifespan. MtDNA levels, mitochondrial transcription as well as steady state levels of OXPHOS protein components are unaffected in mice lacking Mterf2 or Cry1, contradicting a role of MTERF2 in mitochondrial transcription. However, Cry1 expression is decreased in both Mterf2 knockout mouse models, which suggests a putative influence of Cry1 expression when the Mterf2 gene is targeted. The leucine-rich pentatricopeptide repeat domain containing protein (LRPPRC) is an important factor of posttranscriptional regulation of mtDNA expression. Although data from a Lrpprc knockout mouse model and patient fibroblasts carrying decreased LRPPRC protein levels support a role of LRPPRC in mitochondrial mRNA transcript stability and coordination of translation, its in vivo function is still highly debated in the literature. A recent report demonstrated that LRPPRC is involved in mitochondrial transcription initiation through direct interaction with POLRMT. In order to study this protein in a physiological environment we created bacterial artificial chromosome transgenic mice slightly overexpressing LRPPRC and Lrpprc heterozygous knockout mice with moderately decreased LRPPRC levels. Slightly increased or decreased LRPPRC protein levels did not affect steady state transcript levels as well as de novo transcription suggesting that LRPPRC does not have a role in mitochondrial transcription. In addition, increasing amounts of LRPPRC did not stimulate transcription in a recombinant in vitro system and immunoprecipitation as well as size exclusion chromatography did not detect any interaction between LRPPRC and POLRMT.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language In nahezu allen eukaryotischen Zellen sind Mitochondrien die wichtigsten Zellorganellen für die Bereitstellung von Energie in Form von ATP. Neben der Energieproduktion spielen Mitochondrien auch eine wichtige Rolle in der Kalziumhomöostase, Apoptose oder der ß-Oxidierung von Fettsäuren. Auf Grund ihrer Abstammung von Protobakterien besitzen diese Organellen ihre eigene DNA, die für einige mitochondriale OXPHOS Untereinheiten kodiert, aber auch die Information für tRNAs und rRNAs trägt, welche wichtige Komponenten der mitochondrialen Translationsmaschinerie darstellen. Die regulatorische Expression mitochondrialer DNA ist daher unverzichtbar für eine normal funktionierende Atmungskette. Mitochondriale Fehlfunktionen sind oftmals die Ursache für neurodegenerative Krankheiten, Krebs oder Diabetes und werden außerdem mit dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht. Erkenntnisse aus in vitro Studien führten über viele Jahrzehnte zu der Annahme, dass die Transkription der beiden ribosomalen RNAs auf dem schweren mitochondrialen DNA-Strang durch das Protein Mitochondrial transcription factor 1 (MTERF1) reguliert wird, indem es gleichzeitig mit der Promotorregion und seiner Bindestelle interagiert. Diese Studien wurden jedoch nie in einem Tiermodell bestätigt. In der vorliegenden Arbeit wird zum ersten Mal beschrieben, dass sich das Fehlen von MTERF1 in einem Mausmodell nicht auf ribosomale RNA-Level auswirkt. Stattdessen wurden erhöhte RNA-Level auf dem „antisense“ Strang der ribosomalen RNA, und gleichzeitig eine verminderte Promotoraktivität auf dem selben DNA-Strang beobachtet. Diese Daten lassen eine Rolle von MTERF1 in der Transkriptionstermination des leichten DNA-Strangs vermuten, um eine negative Beeinflussung der Transkriptionsmaschinerie auf den Promotor des leichten DNA – Strangs zu verhindern. Studien in Mäusen defizient für MTERF2 ergeben gesunde und fruchtbare Tiere mit einer normalen Lebenserwartung. Die Behandlung dieser Mäuse mit einer ketogenen Diät führt allerdings zu einem muskelspezifischen Phänotyp, der mit einer verminderten Transkriptionsrate und defizienter oxidativer Phosphorylierung in den Mitochondrien einhergeht. Ein zweites in unserem Labor kreiertes Mterf2 knockout Mausmodell kann diese Beobachtungen jedoch nicht bestätigen. Sogenannte „viral traps“, wie sie auch bei der Produktion einer der Mterf2 knockout Mausmodelle benutzt wurden, besitzen sehr starke Promotoren, die die Genexpression in unmittelbarer Umgebung des Zielgens beeinflussen können. Das Gen, das für das Protein chryptochrome 1 (CRY1) kodiert befindet sich nur 1,6 kb vom Mterf2 Gen entfernt und seine Expression könnte von einem viral trap im Mterf2 Gen negative beeinflusst werden. Dies könnte der Grund für die unterschiedlichen Phänotypen beider Mterf2 knockout Mausmodelle sein. Zur Verifizierung dieser Hypothese wurden die beiden Mterf2 knockout Maus Modelle, Cry1 knockout Mäuse und wildtyp Mäuse mittels molekularer Analysen direkt miteinander verglichen. Alle Mausmodelle weisen normale mitochondriale DNA Level, und unveränderte Transkriptionsraten und Proteinlevel von Untereinheiten des OXPHOS Systems auf, was eine Rolle von MTERF2 in mitochondrialer Transkription sehr unwahrscheinlich macht. Die eigentliche Funktion dieses Proteins in vivo ist jedoch immer noch unbekannt. Ein wichtiger Faktor der posttranskriptionalen Regulation ist das leucine-rich pentatricopeptide repeat domain containing protein (LRPPRC). Trotz eindeutiger Erkenntnisse aus einem Lrpprc knockout Mausmodell, die eine Rolle von LRPPRC in der Stabilisierung mitochondrialer mRNAs, sowie der Koordination der Translation unterstützen, ist die in vivo Funktion dieses Proteins immer noch umstritten. So beschreibt eine kürzlich publizierte Studie LRPPRC als mitochondrialen Transkriptionsfaktor, der direkt mit dem Enzym POLRMT interagiert. Um die Funktion von LRPPRC unter physiologischen Bedingungen näher zu untersuchen stellten wir „bacterial artificial chromosome“ (BAC) transgene Mäuse her, die dieses Protein leicht überexprimieren und ebenso Lrpprc heterozygote Mäuse mit leicht reduzierten LRPPRC Proteinmengen. Moderat erhöhte oder verminderte LRPPRC protein Level wirkten sich nicht auf mitochondriale Transkriptlevel oder die absolute Transkriptionsaktivität in Mitochondrien aus, was eine Rolle von LRPPRC als mitochondrialen Transkriptionsfaktor sehr unwahrscheinlich macht. Desweiteren führte die Zugabe von rekombinantem LRPPRC zu einer in vitro Transkriptionsreaktion nicht zu einer Stimulation der Transkription, und Immunpräzipitationsexperimente sowie Gel permeations chromatographische Untersuchungen konnten keine Interaktion zwischen LRPPRC und POLRMT nachweisen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Harmel, Julia jharmel1@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Contributors:	Max-Planck Institut für Biologie des Alterns
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-55204
Date:	2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language mitochondria English gene regulation English transcription factor English
Date of oral exam:	21 January 2014
Referee:	Name Academic Title Larsson, Nils-Göran Prof. Dr. Langer, Thomas Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5520