Universität zu Köln

Eck, Alexander Werner (2014). Trehalose Transport in Corynebacterium glutamicum and its Significance for Cell Envelope Synthesis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Corynebacterium glutamicum ist ein Gram-positives, apathogenes Bodenbakterium. Es ist ein wichtiger industriell genutzter Aminosäureproduzent und dient als Modellorganismus für die Synthese der Zellhülle in verwandten pathogenen Arten wie Mycobacterium tuberculosis, dem Tuberkuloseerreger. Ein auffälliges Merkmal der Zellhülle dieser Bakterien ist das Vorhandensein einer zweiten Per¬meabilitätsbarriere ähnlich der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien. Wichtige Bestandteile sind Trehalosemono- (TMM) und dimycolat (TDM), langkettige Fettsäuren, die mit einem Molekül des Disaccharids Trehalose verestert sind. Frühere Versuche mit C. glutamicum zeigten, dass die Verknüpfung im Periplasma erfolgt, wofür der Export beider Moleküle notwendig ist. Dieses Modell wurde durch neue Studien in Frage gestellt, welche MmpL-Transporter mit dem Export von TMM aus dem Cytosol in Verbindung brachten. Um das beschriebene Modell der TMM-Synthese zu überprüfen, wurde daher in dieser Arbeit der Export von Trehalose untersucht. In einem C. glutamicum Teststamm konnten die cytosolische Umwandlung zuvor aufgenommener Maltose in Trehalose und dessen Exkretion nachgewiesen werden, wobei eine extrazelluläre Um¬wandlung ausgeschlossen wurde. Die bestimmte Exportrate von 0.19 nmol × mg-1 cdw × min-1 ist für die TMM-Synthese während des Wachstums ausreichend und war unabhängig von der Aktivität mechanosensitiver Kanäle, welche Trehalose in anderen Organismen freisetzen, und von der TMM-Synthese. Zusammen mit mechanis¬tischen Analysen der Exkretion deutet dies auf das Vorhandensein eines Trehalosetransporters hin, der diese für die TMM-Synthese im Periplasma bereitstellt. TMM und TDM wurde nur in Zellen nachgewiesen, in denen einer von zwei redundanten MmpL-Transportern aktiv war. Es wird daher ein Modell vorgeschlagen, das eine periplasmatische Synthese von TMM aus zuvor exportierten Substraten und einem MmpL-vermittelten Transport von TMM aus der äußeren Schicht der Plasmamembran zur Mycolatschicht vereint. Da ein rationaler Ansatz nicht zur Identifizierung eines Trehaloseexporters führte, wurde ein genetisch kodierter Trehalosesensor entwickelt und optimiert, welcher für das Screening einer Mutantenbibliothek eingesetzt werden sollte. Die Affinität dieses Sensors konnte jedoch durch gerichtete Mutagenese nicht ausreichend reduziert werden, um eine in vivo-Applikation zu ermöglichen. Der Trehaloseexporter von C. glutamicum ist daher weiterhin unbekannt.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive, non-pathogenic soil bacterium. It is one of the main industrial producers for amino acids and also serves as a model organism for cell envelope synthesis in related pathogenic species like Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis. A common feature of their cell envelope is the presence of a second permeability barrier similar to the outer membrane of Gram-negative bacteria. Important constituents of this lipid bilayer are the glycolipids trehalose monomycolate (TMM) and trehalose dimycolate (TDM), long chain fatty acids esterified to the disaccharide trehalose. Previous experiments with C. glutamicum indicated that the linkage of trehalose and a mycolic acid precursor takes place in the periplasm, necessitating the export of both substrates. This model was challenged by the recently described connection of MmpL transporters to TMM transport from the cytosol to the periplasm. To validate the current model of TMM synthesis, the export of trehalose was investigated in this work. In a C. glutamicum test strain, the cytosolic conversion of imported maltose to trehalose and the excretion of the latter could be shown. The extracellular conversion of substrate to trehalose could be excluded. Trehalose accumulation in the supernatant occurred with a specific rate of 0.19 nmol × mg-1 cdw × min-1, which is sufficient to maintain mycolic acid synthesis during growth. The rate of trehalose excretion was independent of mechanosensitive channels, which mediate trehalose excretion in other bacteria, and of TMM synthesis. Together with mechanistic analyses, this indicates the presence of a carrier dedicated to provide trehalose for TMM synthesis in the periplasm. Confirming the results published by other groups, the detection of TMM and TDM in whole cell extracts was dependent on the activity of either of two MmpL proteins. Nevertheless, a model is presented in this work that allows the periplasmic synthesis of TMM after precursor export and that assumes the MmpL-catalysed transport of TMM from the outer leaflet of the plasma membrane across the periplasm to the outer membrane. A trehalose export carrier could not be identified in a rational approach. Thus, a genetically encoded trehalose sensor was constructed and optimised to allow the screening of a mutant library. Although functional in vitro, the affinity of this sensor for trehalose is still too high and could not be reduced sufficiently by site-directed mutagenesis to allow its application in C. glutamicum. Thus, the trehalose export system of C. glutamicum remains unknown. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Eck, Alexander Werner alexander_eck@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-56196
Date:	2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium glutamicum; Trehalose; Uptake; Export; Mycolic Acid; Lysine; Maltose; English
Date of oral exam:	21 May 2014
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr. Schnetz, Karin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5619