Universität zu Köln

Kallabis, Sebastian (2021). A SYSTEMATIC EXPLORATION OF INSULIN-DEPENDENT PROTEIN NETWORKS BY QUANTITATIVE MASS SPECTROMETRY. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The highly conserved peptide hormone insulin functions as a central regulator of metabolic homeostasis in the human body. So far, several large-scale-omics studies based on proteomics approaches have been performed to investigate intracellular insulin signaling, including glucose uptake, gene regulation, and differentiation. These studies uncovered a plethora of insulin-dependent effectors and revealed complex mechanisms of how these signaling molecules interact. However, detailed functions of large numbers of signaling molecules remained entirely unclear. It became further evident that interactions between signaling pathways are much more complex than initially assumed. This thesis aims to generate large-scale insulin-dependent protein-protein interactomes and phosphoproteomes to decipher the complex mechanisms of insulin signaling pathways in brown adipocytes. For the global protein-protein interactome analysis, nearly 100 proteins were selected which either have known functions in insulin signaling pathways or show insulin-dependent phosphorylation. Bait expression experiments in brown adipocytes were performed for the selected candidates by transient transfection of FLAG-tagged expression constructs and enrichment of bait-specific protein interactors. After immuno-precipitation and highresolution mass spectrometric analysis, samples were analyzed by comprehensive statistical and bioinformatics methods. In a semi-automated workflow, 4,197 binary interactions with 95 baits were identified, and a total of 3,815 interactors showed dynamic interaction behavior in response to insulin. The study uncovered various insulin-dependent interactions, and the enrichment of different protein motifs after insulin stimulation demonstrated a dynamic remodeling of protein interaction communities. In addition, an insulin-dependent phosphoproteomics screen in brown adipocytes discovered 2,334 differentially regulated phosphorylation sites, including sites on 46 bait and 319 prey proteins. A comparative analysis of interaction and phosphorylation kinetics revealed 2,010 interaction-phosphosite pairs with either positively or negatively correlating dynamics indicating activating or inhibiting effects of phosphorylation on protein-protein interactions after insulin stimulation. The correlation of insulin-dependent interactions and phosphorylation kinetics allowed the placement of previously unknown proteins within the insulin signaling pathway. iv For example, several bait proteins were strongly associated with cytoskeletal remodeling and vesicle translocation, including RAI14, SHC3, NCK1, and SH3BP4. Other overrepresented pathways included candidates involved in fatty acid metabolism (CERS1), mRNA translocation, and translation (ZC3H11A). Overall, the workflow presented here can be used to analyze any cellular system after stimulation and therefore provides an unbiased platform to study protein-protein interactions. The data collected in this thesis serves as a repository for exploring insulin-dependent dynamics in brown adipocytes and functionally characterizes several proteins so far not known to be involved in insulin signaling.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Das hoch konservierte Peptidhormon Insulin ist im menschlichen Körper ein zentraler Regulator der Energiehomöostase. Verschiedene großangelegte -omics-Studien untersuchten intrazelluläre Insulinsignalwege, beispielsweise die durch Insulin regulierte Glukoseaufnahme, Genregulation oder Zelldifferenzierung. Dabei wurde eine Vielzahl Insulin-abhängiger Effektoren entdeckt und komplexe Interaktionsmechanismen zwischen diesen Signalmolekülen erkundet. Für die meisten der neu entdeckten Signalmoleküle blieben jedoch die genaue Funktionen innerhalb der Signalwege ungeklärt. Des weiteren zeigte sich, dass die Interaktionen zwischen den verschiedenen Signalwegen weitaus komplizierter verlaufen, als angenommen wurde. Ziel dieser Dissertation ist daher das Erstellen eines detailierten Protein-Protein Interaktionsnetzwerkes, sowie eines Phosphoproteoms nach Insulinstimulierung um komplexe, Insulin-abhängige Signalwege in braunen Adipozyten zu erkunden. Für das Erstellen des globalen Interaktionsnetzwerkes wurden mehr als 100 Proteine ausgewählt, welche entweder bekannte Funktionen in Insulinsignalwegen besitzen oder in Abhängigkeit von Insulin phosphoryliert werden. Zum Anreichern potentieller Interaktoren wurden braune Adipozyten transient mit den ausgewählten, FLAGmarkierten Kandidaten transfiziert und nach Immunprezipitation und hochauflösender massenspektrometrischer Analyse mithilfe verschiedener bioinformatischer Methoden statistisch analysiert. Dabei wurden 4,197 verschiedene binäre Interaktionen mit 95 verschiedenen Proteinkandidation identifiziert, wobei 3,815 dieser Interaktionen ein dynamisches und Insulin-abhängiges Verhalten aufwiesen. Des Weiteren wurde deutlich, dass durch den Insulinstimulus verschiedene Proteinmotive angereichert werden und sich Proteininteraktionsgemeinschaften dynamisch verändern. In dem Insulin-stimulierten Phosphoproteom wurden insgesamt 2,334 signifikant regulierte Phosphorylierungstellen identifiziert, wobei 46 der ausgegälten Proteinkandidaten und 319 Interaktoren ebenfalls Phosphorylierungsstellen aufwiesen. Eine vergleichende Analyse der Interaktions- und Phosphorylierunsdynamiken identifizierte 2,010 Kandidaten mit positiv oder negativ korrelierenden Phosphorylierungen verglichen zu Interaktionsdynamiken, die darauf hinweisen, dass die identifizierten Proteinphosphorylierungen bestimme Interaktion in Abhängigkeit zu Insulin fördern oder inhibieren können. Durch die Korrelation vi dieser Insulin-abhängigen Datensätze konnten verschiedene Proteine mit bisher unbekannter Funktion im Insulinsignalweg im selbigen eingeordnet werden. Mehrere Interaktionskandidaten, nämlich RAI14, SHC3, NCK1 und SH3BP4, interagierten mit Proteinen, die sowohl am Umbau des Zytoskeletts als auch der Vesikeltranslokation beteiligt sind. Weitere Kandidaten konnten Insulin-stimulierten Prozessen wie dem Fettsäuremetabolismus (CERS1) oder mRNA-Translokation und Translation (ZC3H11A) zugewiesen werden. Generell kann der hier präsentierte Arbeitsablauf auch für die Analyse anderer Zellkultursysteme nach Stimulation verwendet werden und ist daher eine unabhängige Plattform zur Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen. Des Weiteren können die hier gesammelten Daten als Datenbank verwendet werden, um Insulin-abhängige Dynamiken in braunen Adipozyten zu studieren und Proteine, die bisher nicht dem Insulinsignalweg zugeordnet worden waren, funktionell zu charakterisieren und einzuordnen. UNSPECIFIED
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kallabis, Sebastian sebastian@kallabis.net UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-610904
Date:	13 November 2021
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Insulin signaling English Brown adipose tissue English Phosphoproteomics English Interaction proteomics UNSPECIFIED
Date of oral exam:	21 January 2022
Referee:	Name Academic Title Krüger, Marcus Prof. Dr. Wunderlich, Thomas PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/61090