Universität zu Köln

Kuiper-Makris, C.E. ORCID: 0000-0002-7940-9612 (2021). Dysregulation of angiogenic signaling and reduced elastic fibers are associated with impaired formation of microvessels in rat lungs after intrauterine growth retardation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Intrauterine growth restriction (IUGR) has been identified as a risk factor for reduced formation of alveoli, extracellular matrix (ECM) remodelling and impaired long-term lung function, features also seen in neonatal Chronic Lung Disease (nCLD). Previous research has shown that pulmonary angiogenesis is essential for alveolarisation, and has linked impaired alveolar formation to dysregulated angiogenesis in various models for nCLD and reduced postnatal lung growth. I therefore hypothesised that IUGR and subsequent postnatal catch-up growth disrupt microvascular formation in late lung development through dysregulation of angiogenic factors, thereby affecting angiogenesis, ECM formation and ultimately alveolarisation. Experiments were performed using frozen lungs and paraformaldehyde (PFA)-fixed lungs of a low-protein diet-induced IUGR rat model at three different time points: embryonic day 21 (E21), postnatal day 3 (P3) and P23. The mRNA and protein expression of endothelial cell markers (Pecam1 and VE-Cadherin) and angiogenic factors (VEGF-family and BMP-family signalling), as well as the nutrient-sensing mTOR and AMPKα pathways were measured in whole lung homogenates, with qRT-PCR and immunoblot, respectively. The quantity of microvessels and elastic fibres was assessed with histomorphometry. In addition, the activity of metalloproteinases was assessed with zymography. The data demonstrate two-phased perinatal programming after IUGR. The intrauterine phase (E21) is characterized by a reduction of endothelial cell markers as well as reduced mRNA expression of angiogenic factors. Protein analysis identified reduced VEGF- and BMP-signalling, as well as an activation of anti-angiogenic mTOR effectors. In the postnatal phase (P23), the lung capillaries (<20μm) are significantly reduced, the expression of angiogenic factors and endothelial cell markers were unaffected, but Smad1/5/8 signalling and Klf4 protein mRNA expression were increased. Zymography demonstrated elevated proteolytic activity of MMP2 and MMP9, linked to a 50% reduction of lung elastic fibres. The results provide initial evidence that IUGR reduces angiogenic signalling in the lung. Even though a catch-up growth induces a stabilisation of angiogenic markers in the postnatal lung, there is a persisting loss of capillaries and disrupted ECM formation, possibly associated with a predisposition for chronic lung diseases.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Intrauterine Wachstumsrestriktion (IUGR) ist ein Risikofaktor für verminderte Alveolenbildung, Veränderungen der extrazellulären Matrix (ECM) sowie einer Minderung der langfristigen Lungenfunktion, wie auch beschrieben in neonataler chronischer Lungenerkrankung (nCLD). Vorarbeiten haben gezeigt, dass die Gefäßbildung essentiell ist für die Alveolenbildung und dass die Störung der Alveolenbildung in verschiedenen Modellen für nCLD und reduziertes postnatales Lungenwachstum auf eine Dysregulation der Gefäßbildung zurück zu führen ist. Diese Kenntnisse führten zu der Hypothese, dass IUGR und das darauffolgende Aufholwachstum die Gefäßentwicklung in den letzten Stadien der Lungenentwicklung dysregulieren und dabei zu einem Entwicklungsstillstand der Lungen führen. IUGR wurde in Ratten durch eine Proteinmangel-Diät (8% Casein; IUGR) der Muttertiere während der Gestation induziert; die Kontroll-Muttertiere erhielten stets Normal-Protein- Diät (17% Casein; Co). Die Lunge wurde an folgenden Zeitpunkten entnommen: embryonalen Tag 21 (E21), postnatalen Tag 1 (P1) und postnataler Tag 23 (P23), und entweder in Paraformaldehyd (PFA) fixiert oder bei -80°C eingefroren. Die mRNA und Protein Expression von Endothelzellmarkern und angiogenetische Faktoren wurde an den Lungenproben mittels qRT-PCR und Westernblot untersucht. Außerdem wurden zur Quantifizierung der Mikrogefäße und elastischen Fasern histomorphologische Untersuchung an den PFA fixierten Lungen durchgeführt. Die erhobenen Daten zeigen eine zweiphasige Programmierung nach IUGR. Die intrauterine Phase kennzeichnet sich durch eine Minderung der Endothelzellmarker und angiogenetischen Faktoren. Proteinanalysen zeigten reduzierte VEGF- und BMP- Signalkaskaden, sowie eine Aktivierung der anti-angiogenetischen mTOR-Kaskade. In der postnatalen Phase zeigten sich die Endothelzellmarker unverändert, allerdings war die Anzahl der Kapillaren signifikant reduziert, begleitet von einer erhöhten Smad1/5/8 und Klf4 Protein Expression. Zudem zeigte sich in die Zymographie eine erhöhte Aktivität von MMP2 und MMP9, im Zusammenhang mit einer 50%-igen Reduktion der elastische Fasern. Die Ergebnisse zeigen zum ersten Mal einen negativen Effekt von IUGR auf die pränatale Expression von angiogenetischen Faktoren und die Lungengefäßbildung. Obwohl sich während des Aufholwachstums die Expression der angiogenetischen Faktoren normalisiert, zeigt sich eine dauerhaft reduzierte Anzahl von Kapillaren und Veränderung der ECM, welche zu einer Prädisposition für CLD beitragen könnten. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kuiper-Makris, C.E. centina.kuiper-makris@uk-koeln.de orcid.org/0000-0002-7940-9612 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-629395
Date:	16 March 2021
Language:	English
Faculty:	Faculty of Medicine
Divisions:	Faculty of Medicine > Kinder- und Jugendmedizin
Subjects:	Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Intrauterine growth retardation English Angiogenesis English
Date of oral exam:	28 January 2022
Referee:	Name Academic Title Alejandre-Alcazar, M.A. Juniorprofessor Dr. med. Dr. nat. med. Brachvogel, B. Universitätsprofessor Dr. rer. nat.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/62939