The oncogenic role of the lysine-specific demethylase KDM1A in chronic lymphocytic leukemia

Jiang, Qu ORCID: 0000-0001-8517-7750 (2023). The oncogenic role of the lysine-specific demethylase KDM1A in chronic lymphocytic leukemia. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

PDF (Doctoral Dissertation)
Thesis_Qu Jiang_Final.pdf
Download (22MB)

DOI:10.1182/blood.2022017230

Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most prevalent leukemia in adults in the Western world. Despite the advances in the identification of various genomic and molecular alterations and the management of treatment for CLL, it remains an incurable disease. Epigenetic alterations are considered to centrally shape the transcriptional signatures that drive disease evolution and underlie the biological and clinical subsets in CLL. However, characterizations of epigenetic regulators, particularly histone-modifying enzymes, are very rudimentary in CLL. Aberrant expression of the T-cell leukemia/lymphoma 1A (TCL1A) proto-oncogene is a hallmark of CLL and high TCL1A levels are associated with aggressive disease features. As a well-accepted disease model, Eμ-TCL1A transgenic (tg) mice produce B-cell proliferations that closely resemble human CLL. In the context of the yet-evolving molecular concept of the 14kDa TCL1A protein, it was shown that TCL1A interacts with the DNA methyltransferase 3A (DNMT3A), thereby reducing its enzymatic activity and contributing to epigenetic reprogramming in CLL. Fittingly, induced mono- or bi-allelic losses of Dnmt3a result in murine CLL. Nevertheless, the functional network around TCL1A, particularly with epigenetics, is incomplete and as a causal oncogene in CLL, a better molecular understanding would help in improving disease concepts and treatment rationales in this still incurable neoplasm. Here, we identify the epigenetic modifier, lysine-specific demethylase KDM1A as a novel interaction partner of the TCL1A protein in B cells. This demethylase has been implicated in many cancer entities and its overexpression has been linked to poor prognoses. Currently, KDM1A inhibitors are being investigated for cancer therapy in clinal trials. In this context, we proposed that KDM1A is involved in CLL pathogenesis by altering its epigenetic landscape. Therefore, we set out to address: (1) how does TCL1A affect KDM1A’s function/activity? (2) what are the biological outcomes of increased KDM1A levels in CLL? (3) which KDM1A-mediated pathways contribute to the biology of CLL? To address these central questions, we have analyzed the subcellular localization of TCL1A and KDM1A as well as their interacting complex. TCL1A interacted with KDM1A in the nucleus. Interestingly, their protein interaction increased the histone demethylase activity of KDM1A in B cells. TCL1A also affected histone posttranslational modifications (PTMs). Furthermore, we could show that KDM1A is overexpressed in CLL B cells as compared to healthy B cells. By analyzing the gene expression profiling (GEP) data of patients included in the CLL8 trial, we demonstrated that higher KDM1A expression levels and the associated gene signatures correlate with adverse clinical characteristics and unfavorable clinical outcomes, e.g., higher white blood cell (WBC) counts, higher serum thymidine kinase levels, a higher rate of TP53 mutations/deletions, and shorter progression-free survival (PFS). In addition, enrichment of different pathways involved in tumor progression was also associated with KDM1A expression levels. Next, we took advantage of the doxycycline (Dox)-inducible Kdm1a knockdown mouse model and the TCL1A-tg Eμ-TCL1A mice to achieve a whole-organismal Kdm1a knockdown in murine CLL. The genetic Kdm1a depletion in Eµ-TCL1A mice reduced the leukemic burden in peripheral blood, spleen, and bone marrow. This was accompanied by upregulation of p53 and pro-apoptotic pathways identified by RNA-sequencing analysis. The analysis of differentially expressed genes (DEGs) upon Kdm1a knockdown suggested that Kdm1a acts as a transcriptional repressor in murine CLL. This might be due to enrichment of regulatory elements of upregulated genes with H3K4 methylation upon the Kdm1a knockdown, which leads to activation these genes. Thus, we performed chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experiments, which demonstrated an increase in H3K4me3 marks in Kdm1a knockdown leukemic cells. Moreover, KDM1A expression in the components of the microenvironment had an impact on their support for CLL progression. The loss of KDM1A in monocytic cells and stromal cells led to impaired support of CLL cell proliferation and survival in vitro. Notably, Kdm1a knockdown in Eµ-TCL1A prolonged the overall survival (OS) of leukemic animals. In vitro, KDM1A inhibition by the pharmacologic compound C12 induced apoptosis and increased H3K4/9 target methylation levels in leukemic B cells. Overall, in completion of all aims, we established a relevant pathogenic role for KDM1A in CLL, as a pro-oncogenic molecule in CLL cells and in components of their microenvironment. Our data further provide a rationale for therapeutic KDM1A inhibition in CLL.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie bei Erwachsenen in der westlichen Welt. Trotz Fortschritte bei der Identifizierung verschiedener genomischer und weiterer molekularer Veränderungen und bei der Behandlung der CLL, ist diese Krankheit nach wie vor unheilbar. Es wird davon ausgegangen, dass epigenetische Veränderungen die Transkriptionssignaturen, welche die Krankheitsentwicklung vorantreiben und den biolo-gischen sowie klinischen Untergruppen der CLL zugrunde liegen, entscheidend beeinflussen. Die Charakterisierung epigenetischer Regulatoren, insbesondere von Histon-modifizierenden Enzymen, ist bei der CLL bisher jedoch sehr rudimentär. Eine abnorme Expression des T-cell leukemia/lymphoma 1A (TCL1A) Proto-Onkogens ist ein weiteres zentrales Kennzeichen der CLL. Hohe TCL1A Level sind mit aggressiven Krank-heitsmerkmalen assoziiert. Als anerkanntes Tumormodell der CLL erzeugt humanes TCL1A in Eμ-TCL1A transgenen (tg) Mäusen reife B-Zell Neoplasien, die der menschlichen CLL sehr ähnlich ist. Im Rahmen des sich entwickelnden molekularen Konzepts des 14kDa TCL1A Proteins wurde gezeigt, dass es mit der DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A) interagiert und dadurch deren enzymatische Aktivität verringert und zur epigenetischen Umprogrammi-erung der CLL beiträgt. Passend dazu führt der induzierte mono- oder bi-allelische Verlust von Dnmt3a zu CLL bei Mäusen. Dennoch ist das funktionelle Netzwerk um TCL1A, insbe-sondere in Bezug auf dessen Einfluss auf die epigenetische Landschaft, unvollständig. Jedoch würde ein besseres molekulares Verständnis dieses Onkogens der CLL dazu bei-tragen, Krankheitskonzepte und Behandlungsrationalen dieser weiterhin inkurablen Neoplasie weiter zu verbessern. In dieser Arbeit identifizierten wir den epigenetischen Modulator namens lysin-spezifische Demethylase KDM1A, als einen neuen Interaktionspartner des TCL1A Proteins in B-Zellen. Diese Demethylase wurde bei vielen Krebsarten nachgewiesen, und ihre Überexpression wurde mit einer jeweils schlechten Prognose in Verbindung gebracht. Derzeit werden KDM1A-Inhibitoren für die Therapie verschiedener Krebsarten in klinischen Studien unter-sucht. In diesem Zusammenhang postulierten wir, dass KDM1A an der Pathogenese der CLL beteiligt ist, indem es die epigenetische Landschaft verändert. Deshalb haben wir uns mit folgenden Fragen beschäftigt: (1) Wie beeinflusst TCL1A die Funktion/Aktivität von KDM1A? (2) Was sind die biologischen Konsequenzen erhöhter KDM1A-Konzentrationen in der CLL? (3) Welche KDM1A-vermittelten Signalwege tragen zur Pathogenese der CLL bei? Um diese zentralen Fragen zu beantworten, haben wir zunächst die subzelluläre Lokalisier-ung von TCL1A und KDM1A sowie deren interagierende Proteinkomplexe analysiert. TCL1A interagierte mit KDM1A im Zellkern. Interessanterweise erhöhte diese Proteininteraktion die Histondemethylase-Aktivität von KDM1A in B-Zellen. TCL1A beeinflusste zudem posttransla-tionale Histon-Modifikationen (PTMs). Außerdem konnten wir zeigen, dass KDM1A in CLL-B-Zellen im Vergleich zu gesunden B-Zellen überexprimiert ist. Durch die Analyse von Genex-pressionsprofilen (GEP) von Patientenproben aus der prospektiven CLL8-Studie konnten wir eine Korrelation zwischen einer erhöhten KDM1A-Expression, welche mit bestimmten Gen-signaturen assoziiert ist, und prognostisch ungünstigen klinischen Merkmalen und Verläufen nachweisen, z. B. mit einer höheren Leukämiezellzahl im Blut, höheren Thymidinkinase-Serumspiegeln, einer höheren Rate an TP53-Mutationen/Deletionen und einem kürzeren pro-gressionsfreien Überleben. Darüber hinaus wurde das vermehrte Vorkommen verschiedener an der Tumorprogression beteiligter Signalwege mit dem KDM1A-Expressionsniveau in Verbindung gebracht. Als Nächstes nutzten wir ein Doxycyclin (Dox)-induzierbares Kdm1a-Knockdown-Mausmodell und TCL1A-tg Eμ-TCL1A-Mäuse. Die Kombination beider Modelle erlaubte es, einen Kdm1a-Knockdown im gesamten Organismus bei muriner CLL zu erreichen. Die ge-netische Kdm1a-Depletion in Eµ-TCL1A-Mäusen reduzierte die leukämische Last im periph-eren Blut, in der Milz und im Knochenmark. Dies ging in RNA-Sequenzieranalysen mit einer Hochregulierung von p53 sowie pro-apoptotischer Signalwege einher. Die Analyse der differ-entiell exprimierten Gene (DEGs) nach Kdm1a-Knockdown deutet darauf hin, dass Kdm1a bei der murinen CLL als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies könnte auf eine Anreicher-ung regulatorischer Elemente von hochregulierten Genen mit H3K4-Methylierung zurückzuführen sein, was zu deren Aktivierung nach Kdm1a-Knockdown führt. Daher führten wir Experimente der Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierung (ChIP-seq) durch. Diese zeigten eine Zunahme der H3K4me3-Markierungen in leukämischen Kdm1a-Knockdown Zellen. Darüber hinaus hat die Expression von KDM1A in Komponenten des Mikromilieus einen Einfluss auf deren Unterstützung der CLL Progression. Der Verlust von KDM1A in monozytären und Stromazellen führte zu einer beeinträchtigten Unterstützung der CLL-Proliferation und des Überlebens der Tumorzellen. Insbesondere verlängerte der Knockdown von Kdm1a in Eµ-TCL1A das Überleben leukämischer Tiere. In vitro induzierte die Hemmung von KDM1A durch den Wirkstoff C12 Apoptose und erhöhte die Methylierungs-level von H3K4/9-Zielsequenzen in B-Zelllinien und CLL-Patientenproben. Insgesamt konnten wir eine relevante pathogenetische Rolle von KDM1A bei CLL als pro-onkogenes Molekül in CLL-Zellen und ihrem Mikromilieu nachweisen. Zudem liefern unsere Daten eine Rationale für die therapeutische Hemmung von KDM1A in der CLL, zumindest als synergistischer Partner in Kombinationsstrategien.

German

Creators: