Universität zu Köln

Villamor-Sernestrand, Joji Grace (2016). Profiling protein kinases and other ATP-binding proteins in Arabidopsis using acyl-ATP probes. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Many protein activities are driven by ATP binding and hydrolysis. Here, we explore the ATP binding proteome of the model plant Arabidopsis thaliana using acyl ATP (AcATP) probes. AcATP targets ATP binding sites and covalently labels lysine residues in the ATP binding pocket. Gel-based profiling using biotinylated AcATP showed that labelling is dependent on pH and divalent ions, and can be competed by nucleotides. The vast majority of the AcATP-labelled proteins are known ATP binding proteins. Our search for labelled peptides upon in-gel digest led to the discovery that the biotin moiety of the labelled peptides is oxidized. Also, the in-gel analysis displayed kinase domains of two receptor-like kinases (RLKs) at a molecular weight lower than expected, indicating that these RLKs lost the extracellular domain, possibly as a result of receptor shedding. This putative shedding mechanism is further investigated in a case study of receptor-like kinase RLK902. We found that heterologous expression of RLK902 in N. benthamiana leaves causes RLK902 processing that can be inhibited by protease inhibitors E64d and TLCK. Sequence analysis of RLK902 reveals four putative internalization motifs suggesting endocytosis of RLK902 into vesicles. A nuclear localization signal in the kinase domain hints at a possible nuclear transport upon cleavage of RLK902. However, deeper study of the mechanism underlying the RLK902 processing is needed. Gel-free profiling using desthiobiotinylated AcATP identified 242 different AcATP labelling sites in the Arabidopsis proteome. Analysis of labelling sites revealed a preference of labelling in ATP binding pockets for a broad diversity of ATP binding proteins. Of these, 24 labelled peptides were from a diverse range of protein kinases (PKs), including RLKs, mitogen-activated protein kinases (MPKs), and calciumdependent protein kinases. A significant portion of the labelling sites could not be assigned to known nucleotide binding sites. However, the fact that labelling could be competed with ATP indicates that these labelling sites might represent previously uncharacterized nucleotide binding sites. A plot of spectral counts against expression levels illustrates the high specificity of AcATP probes for PKs and known ATP binding proteins. AcATP profiling, coupled to targeted MS/MS, of proteomes of Arabidopsis cell cultures treated with or without flg22 did not show differential AcATP labelling of differentially activated MPKs. This was further investigated using phosphomimic and phosphomutant versions of MPKs that were heterologously expressed in bacteria. These assays confirmed that AcATP labelling is not affected by the phosphorylation (activation) state of the proteins. Overall, this work reveals important opportunities and limitations of profiling ATP binding activities of a large diversity of proteins in plant proteomes.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Aktivität vieler Proteine hängt von deren Bindung und Hydrolyse von ATP ab. In dieser Studie wurde das ATP-bindende Proteom in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana mit Hilfe molekularer Sonden, welche Acyl-ATP (AcATP) enthalten, untersucht. Bei entsprechenden Ziel-Proteinen bindet AcATP kovalent an Lysin- Reste innerhalb der ATP-Bindungsstellen. Untersuchungen mit biotinyliertem AcATP zeigen hierbei, dass der Grad der Markierung sowohl vom pH-Wert, als auch vom Gehalt an zweiwertigen Ionen abhängt, und durch Nukleotide verhindert werden kann. Den größten Teil der AcATP-markierten Proteine bilden bereits bekannte ATPbindende Proteine. Proteolytische Untersuchungen der markierten Peptide führten hierbei zu der Entdeckung, dass deren Biotin-Gruppe oxidiert vorliegt. Es wurden darüber hinaus zwei Rezeptor-like Kinasen (RLKs) mit einem unerwartet geringen Molekulargewicht identifiziert – möglicherweise als Resultat der Abspaltung der extrazellulären Bereiche der RLKs durch Rezeptor-Shedding. Dieser potentielle Abspaltungsmechanismus wurde anhand der Rezeptor-like Kinase RLK902 weiter untersucht. Die heterologe Expression von RLK902 in Blättern von Nicotiana benthamiana zeigt eine Prozessierung der Kinase, was wiederum durch die Protease-Inhibitoren E64d und TLCK verhindert werden kann. Analysen der Sequenz von RLK902 ergeben vier Abschnitte für eine mögliche endozytotische Internalisierung von RLK902 in Vesikel. Darüber hinaus konnte innerhalb der Kinase-Domäne eine Sequenz zur Lokalisierung im Zellkern identifiziert werden, was auf einen möglichen Zellkern-Transport von RLK902 nach der Spaltung hindeutet. Zum Verständnis der Prozessierung von RLK902 sind jedoch weitere Versuche notwendig. Weitere Untersuchungen des A. thaliana-Proteoms mit desthiobiotinyliertem AcATP führten zur Identifizierung von 242 verschiedenen AcATP-Markierungsstellen in der Modellpflanze. Für eine Vielzahl verschiedener ATP-bindender Proteine konnte hierbei eine Präferenz der Markierung an den ATP-Bindungsstellen gezeigt werden. 24 dieser Proteine gehören zu einer diversen Gruppe von Proteinkinasen (PKs), bestehend aus RLKs, Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAP-Kinasen) und Kalzium-abhängigen Proteinkinasen. Eine signifikante Anzahl der AcATPMarkierungsstellen kann dagegen keiner bekannten Nukleotid-Bindesequenz zugeordnet werden. Es könnte sich hierbei jedoch um bisher nicht identifizierte Nukleotid-Bindestellen handeln, da die Markierung mit AcATP durch ATP verhindert wird. Generell zeigen molekulare AcATP-Sonden eine hohe Spezifität für PKs und weitere bekannte ATP-bindende Proteine, wie eine graphische Darstellung der spektralen Zählerstände gegen das Expressionslevel demonstriert. Weitere Versuche deuten darauf hin, dass die Markierung mit AcATP in A. thaliana nicht mit dem Phosphorylierungs- bzw. Aktivierungs-Zustand eines Proteins zusammenhängt. So zeigen MPKs in verschiedenen Aktivierungszuständen aus Flg22-behandelten und unbehandelten Zellkulturen keinen Unterschied bezüglich der AcATPMarkierung. Dies bestätigten auch Untersuchungen nach heterologer Expression von phospho-mimetischen und unphosphorylierten Mutanten von MPKs in Bakterienzellen. Insgesamt zeigt diese Arbeit bedeutende Möglichkeiten und auch Limitierungen bei der Untersuchung von ATP-Bindungsaktivitäten innerhalb des sehr diversen pflanzlichen Proteoms. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Villamor-Sernestrand, Joji Grace jgcvillamor@yahoo.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-65496
Date:	2016
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language proteomics UNSPECIFIED ATP-binding proteins UNSPECIFIED protein kinases UNSPECIFIED
Date of oral exam:	22 January 2015
Referee:	Name Academic Title Parker, Jane Prof. Dr. Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr. Andreasson, Erik Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6549