Untersuchung der Quartärstruktur der Proteinkinase CK2: Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung der CK2α/β-Interaktion sowie von Hemmstoffen dieser Protein-Protein-Wechselwirkung

Lauwers, Miriam (2023). Untersuchung der Quartärstruktur der Proteinkinase CK2: Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung der CK2α/β-Interaktion sowie von Hemmstoffen dieser Protein-Protein-Wechselwirkung. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die Proteinkinase CK2 ist für die Entwicklung und das Überleben aller Eukaryoten von großer Bedeutung und spielt außerdem in verschiedenen Krankheitsbildern, insbesondere inverschiedenen Tumoren, eine entscheidende Rolle. Ein wichtiger Aspekt ihrer Aktivität ist das Zusammenspiel ihrer Untereinheiten: Die katalytischen Untereinheiten CK2α und CK2α‘ können für sich oder an die regulative CK2β gebunden vorkommen und verändern je nach Bindungszustand ihre Substratspezifizität und andere Eigenschaften, wie Thermostabilität und die Fähigkeit, Membranen zu penetrieren. CK2β kann darüber hinaus auch an einige andere Proteinkinasen binden. Aufgrund ihrer Bedeutung im onkologischen Bereich gibt es reges Interesse an der Entwicklung von CK2-Hemmstoffen. Dabei ist die Entwicklung von Hemmstoffen für die CK2α/β-Interaktion ein vielversprechender Ansatz, da diese Hemmstoffe das Potential haben, sehr spezifisch CK2 zu hemmen. Dies ist sowohl für die Erforschung der CK2α/β-Interaktion von Vorteil als auch in der klinischen Anwendung, wo solche Hemmstoffe potenziell weniger unerwünschte Effekte durch die Hemmung anderer Proteinkinasen entwickeln. Es gibt bereits eine Reihe CK2α/β-Interaktionshemmer auf peptidischer Basis, anderseits sind nur wenige kleine, nichtpeptidische Moleküle bekannt, die diese Interaktion hemmen. Für die Erforschung von Hemmstoffen, also auch CK2α/β-Interaktionsinhibitoren, sind Hochdurchsatz-Screenings mit vielen tausenden Substanzen von großer Bedeutung. Um solche Screenings durchführen zu können, werden geeignete Methoden benötigt; diese müssen in Mikrotiterplatten-Formaten durchführbar sein und sind idealerweise weitgehend automatisierbar. Für die CK2α/β-Interaktion gibt es bisher nur einen solchen Assay. Dieser Fluoreszenzanisotropie-basierte Assay bildet jedoch nicht die gesamte CK2α/β-Bindungsstelle ab und hat daher nur begrenzte Aussagekraft für die Aktivität von Hemmstoffen in der Praxis. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Hemmstoffen der CK2α/β-Interaktion auf ihre Aktivität untersucht mit der Absicht, diese durch die Feststellung von Struktur-Aktivitätsbeziehungen zu optimieren. Mittels Microscale Thermophoresis (MST) wurde für sämtliche Substanzen der WMS66-Reihe untersucht, inwieweit sie die CK2α/β-Interaktion hemmen. Dazu wurde die Dissoziationskonstante K D der CK2α/β-Interaktion in An- und Abwesenheit der Substanzen ermittelt und bei den Substanzen, in denen diese Werte sich statistisch signifikant unterschieden, wurde die Inhibitionskonstante K i berechnet. Es ist gelungen, die Ausgangssubstanz W16 (K i = 31 ± 14 μM) bezüglich ihrer Hemmung der CK2α/β-Interaktion zu optimieren, so hat die aktivste dieser Substanzreihe, WMS66-22, einen K i von 1,9 ± 0,8 μM. Es ist gelungen, einige Strukturmerkmale zu bestimmen, die die Inhibitorwirkung dieser Substanzreihe beeinflussen; klare globale Struktur-Aktivitätsbeziehungen ließen sich allerdings nicht feststellen, was möglicherweise auf ein komplexeres Bindungsverhalten dieser Substanzen hinweist, das sich je nach Verbindung unterscheidet. Weiterhin wurde ein hochdurchsatzfähiger Assay zur Messung der CK2α/β-Interaktion entwickelt, der auf Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) beruht und zur Erforschung von Hemmstoffen dieser Interaktion geeignet ist. Dazu wurden die für diese Methode entworfenen rekombinanten Fusionsproteine, EGFP-CK2α1-335 und mCherryCK2β1-193 in Escherichia coli (E. coli ) exprimiert und mittels Affinitätchromatographie aufgereinigt. Zuerst wurde mit nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (nPAGE) und MST festgestellt, dass die rekombinanten Proteine wie die natürlichen CK2-Untereinheiten miteinander interagieren. Dann wurde FRET gemessen und mithilfe von Korrekturfaktoren der FRET-Index FRETc berechnet. Hiermit wurde eine Dissoziationskonstante für die Interaktion von EGFP-CK2α1-335 und mCherry-CK2β1-193 von 6,7 ± 1,7 nM ermittelt, die gut mit den durch andere Methoden ermittelten K D–Werten für die CK2α/β-Interaktion übereinstimmt. Außerdem wurde gezeigt, dass sowohl unmarkierte CK2β1-193 als auch die bereits bekannten kompetitiven CK2α/β-Interaktionshemmer, I-Pc und ARC-3140, die Interaktion von EGFP-CK2α1-335 und mCherry-CK2β1-193 inhibieren, wobei die Inhibitionskonstanten für die Hemmung mit früheren Ergebnissen übereinstimmen. Interessanterweise stellte sich die Inhibitionskurve von ARC-3140 als biphasische Hemmkurve dar, was möglicherweise die verschiedenen Bindungsmechanismen des Moleküls an seine Bindungsstellen an CK2α abbildet.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Protein kinase CK2 is essential for the development and survival of all eukaryotes and also plays a crucial role in various pathologies, especially in various tumors. An important aspect of its activity is the interplay of its subunits: The catalytic subunits CK2α and CK2α' can occur on their own or bound to the regulatory CK2β. Depending on the binding state their substrate specificity and other properties, such as thermostability and the ability to penetrate membranes, change. In addition, CK2β can also bind to other protein kinases. Because of its importance in the oncology field, there is active interest in the development of CK2 inhibitors. In this regard, the development of inhibitors for the CK2α/β interaction is a promising approach, as these inhibitors have the potential to inhibit CK2 with high spectificity. This is advantageous both for the study of the CK2α/β interaction and in clinical applications, where such inhibitors potentially develop fewer adverse effects by inhibiting other protein kinases. A number of peptide-based CK2α/β interaction inhibitors already exist; however, only a few small, nonpeptide molecules are known to inhibit this interaction. High-throughput screens involving thousands of compounds are of great importance for the study of inhibitors, including CK2α/β-interaction inhibitors. Appropriate methods are needed to perform such screenings; these must be feasible in microplate formats and ideally can be largely automated. For the CK2α/β interaction, only one such assay exists to date. However, this fluorescence anisotropy-based assay does not represent the entire CK2α/β binding site and therefore has limited predictive power for inhibitor activity in the field. In this work, a series of inhibitors of the CK2α/β interaction were screened for activity with the intention of optimizing them by establishing structure-activity relationships. Microscale thermophoresis (MST) was used to investigate the extent to which all compounds in the WMS66 series inhibit the CK2α/β interaction. For this purpose, the dissociation constant K D of the CK2α/β interaction was determined in the presence and absence of the substances, and for the substances for which these values showed a statistically significant difference, the inhibition constant K i was calculated. It was possible to optimize the initial substance W16 (Ki = 31 ± 14 μM) with respect to its inhibition of the CK2α/β interaction, so that the most active of this series of substances, WMS66-22, has a Ki of 1.9 ± 0.8 μM. It was possible to determine some structural features affecting the inhibitory activity of this series of compounds; however, clear global structure-activity relationships could not be established, possibly indicating a more complex binding behavior of these compounds that differs depending on the compound. Furthermore, a high-throughput assay for measuring the CK2α/β interaction based on Förster resonance energy transfer (FRET) was developed and is suitable for exploring inhibitors of this interaction. To this end, the recombinant fusion proteins designed for this method, EGFPCK2α1- 335 and mCherry-CK2β1-193 were expressed in Escherichia coli (E. coli ) and purified by affinity chromatography. First, native polyacrylamide gel electrophoresis (nPAGE) and MST were used to confirm that the recombinant proteins interacted like the natural CK2 subunits. Then FRET was measured and FRET index FRETc was calculated using correction factors. This resulted in a dissociation constant for the interaction of EGFP-CK2α1-335 and mCherry-CK2β1-193 of 6.7 ± 1.7 nM, which agrees well with K D values for the CK2α/β interaction determined by other methods. In addition, unlabeled CK2β1-193 as well as the previously reported competitive CK2α/β interaction inhibitors, I-Pc and ARC-3140, were shown to inhibit the interaction between EGFP-CK2α1-335 and mCherry-CK2β1-193, with inhibition constants consistent with previous results. Interestingly, the inhibition curve of ARC-3140 presented as a biphasic inhibition curve, possibly mapping the different binding mechanisms of the molecule to its binding sites on CK2α.

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